[发明专利]一种基于高通量测序的线粒体基因组测序文库的构建方法及扩增引物

说明书

本发明公开了一种基于高通量测序的线粒体基因组测序文库的构建方法及扩增引物。该扩增引物包括引物对1和引物对2；引物对1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示，引物对2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和4所示。本发明只需两对扩增引物，通过一次PCR扩增，即可获得足量的线粒体DNA样本，大大减少了繁杂的引物量和成本的投入，并简化操作。本发明通过两对引物的扩增产物混合建库，提高了mtDNA的完整性和准确性，保证数据分析的有效性。

技术领域

本发明属于高通量测序技术领域，涉及一种基于高通量测序的线粒体基因组测序文库的构建方法及扩增引物。

背景技术

线粒体是细胞能量的制造工厂，是生物体能量代谢的重要细胞器。人类线粒体基因组呈双链环状结构，大小为16569bp，编码13个参与ATP合成过程的功能蛋白、22个tRNA和2个rRNA。线粒体DNA没有组蛋白的保护，且位于高度氧化的环境中，具有高突变率的特点。这些突变引起基因结构的改变，影响了线粒体功能，造成氧化磷酸化和能量代谢异常，最终引起疾病的发生，如常见的KSS综合征、Leigh氏综合征等。

检测线粒体DNA的突变，当前已有不少方法可以用来对线粒体DNA进行测序。通过一代Sanger测序，可以检出异质性大于10％以上的突变位点。而基于高通量测序技术对线粒体DNA的测序方法，主要有以下几种：一是线粒体DNA分离法，通过氯化铯密度梯度离心、柱层析和碱变性等方法，将线粒体基因组从细胞中分离出来进行测序；二是探针杂交捕获法，合成与mtDNA互补的寡核苷酸探针，与mtDNA杂交后，捕获、富集目的片段，再进行高通量测序；三是PCR扩增法，通过一对或多对引物，特异扩增线粒体DNA，随后进行高通量测序。

传统的一代测序技术，由于低灵敏度和高成本，已难以适应线粒体基因组测序的要求。新一代测序技术的发展，为复杂和低频率mtDNA异质性突变的检测，提供了良好的技术保障。氯化铯梯度离心分离的线粒体基因组产量低，对人力、时间和样本量的要求较高。而探针杂交捕获法，价格昂贵，操作繁琐。PCR扩增法中，短片段扩增需要设计多对引物，组合使用各种引物集，操作较为繁琐，且成本提高；而长片段扩增，一些方法通过分段扩增，集合完整的线粒体DNA，但存在当引物结合位点突变而无法扩增的缺陷，或存在能相互校正的分段扩增方法，但需要将不同的扩增产物分别进行后续纯化、建库的工作，使工作量和试剂成本成倍增加。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，针对目前方法都存在一些操作或成本上的局限，本发明提供一种基于高通量测序技术的简单、经济、快速的线粒体DNA PCR扩增引物组合和测序方法。该引物组合只需两对扩增引物，通过一次PCR扩增，即可获得足量的可相互校正的线粒体DNA样本，即当其中一对引物因突变而未能扩增时，另一对引物仍能扩增获得完整DNA样本，同时两对引物扩增所得的片段，无需纯化，可直接合并进行后续建库工作，大大减少了繁杂的引物量和成本的投入，并简化操作。

为了解决技术问题，本发明一方面提供了一种人线粒体扩增引物，其包括引物对1和引物对2；

所述引物对1的上游引物MT1-F如SEQ ID NO.1所示，下游引物MT1-R如SEQ IDNO.2所示，所述引物对2的上游引物MT2-F如SEQ ID NO.3所示，下游引物MT2-R如SEQ IDNO.4所示。

本发明还提供了一种用于构建线粒体基因组测序文库的试剂盒，其包括所述的人线粒体扩增引物。

本发明另一方面提供了一种人线粒体基因组扩增方法，其包括如下步骤：

以全血DNA为模板，采用所述的人线粒体扩增引物进行PCR扩增。