[发明专利]肝素裂解酶在枯草芽孢杆菌中的融合表达及其应用

说明书

本发明公开了肝素裂解酶在枯草芽孢杆菌中的融合表达及其应用，属于生物工程技术领域。本发明以枯草芽孢杆菌为宿主异源表达Bacteroides thetaiotaomicron来源的肝素裂解酶I，通过N端融合寡肽序列，优化启动子及5'UTR序列，并于BhepI基因C端用GGGGS短肽连接肝素裂解酶III的基因FhepIII，构建融合酶BhepI‑FhepIII，通过两者对肝素钠裂解能力的比较，发现融合酶得到的肝素分子量可低至1300Da以下，且其抗凝血活性更强，为肝素裂解酶在枯草芽孢杆菌中的工业化生产及低分子量肝素制备奠定了基础。

技术领域

本发明涉及肝素裂解酶在枯草芽孢杆菌中的融合表达及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

肝素，是一种复杂、分散、高度磺酸化的线性糖胺聚糖，广泛存在于细胞表面和胞外基质中，糖链由N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸通过1-4糖苷键连接而成的二糖单元组成。肝素在机体内作为细胞识别、信号传递和抗凝血等的生物活性分子，在临床上长期被用作抗凝血药物，广泛用于内科和防止手术后血栓的形成，但对人体有一定的副作用，如影响血小板的稳定导致手术后大出血等。相比于未分级肝素，低分子量肝素(3000-8000Da)不仅抗凝血活性强、易被机体吸收利用、副作用低，还具有更高的药理活性可预测性和更高的生物利用率。因此，制备低分子量肝素是非常有必要的。

低分子量肝素的制备方法主要有化学降解法(亚硝酸降解法、过氧化氢降解法等)、物理制备法(超滤法、凝胶层析法等)、化学合成法、生物解聚法等。其中，通过生物酶法使用肝素裂解酶在温和的反应条件下专一性制备特定低分子量的肝素越来越受到关注，是目前最常用的降解肝素的方法。肝素裂解酶是一类能够将肝素或硫酸乙酰肝素裂解成不饱和二糖及寡糖的一类糖胺聚糖裂解酶，目前国内外学者已经鉴定并表征了黄杆菌属、芽孢杆菌属、拟杆菌属、鞘氨醇杆菌属及铜绿假单胞菌等微生物来源的肝素裂解酶。

其中，肝素裂解酶I(BhepI)偏好底物磺酸化程度高的肝素结构，可特异性催化肝素结构中连接含有2-3个硫酸基团的二糖单元的1,4糖苷键；肝素裂解酶III(FhepIII)偏好底物磺酸化程度低的硫酸乙酰肝素结构；两者皆可将肝素裂解为低分子量肝素。目前现有肝素裂解酶的表达量都较低，限制了其在制备肝素寡糖方面的应用。

发明内容

[技术问题]

对肝素裂解酶进行异源的表达优化及融合表达是提高酶活与表达量，改善肝素裂解能力的重要途径，并由此获得更高抗凝血活性的低分子量肝素。

[技术方案]

本发明提供了一种融合表达肝素裂解酶的方法，所述方法是将来源于Bacteroides thetaiotaomicron的肝素裂解酶I和肝素裂解酶III利用连接肽融合并在枯草芽孢杆菌中表达。

在一种实施方式中，所述肝素裂解酶I的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述肝素裂解酶III的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，将肝素裂解酶III融合于肝素裂解酶I的N端。

在一种实施方式中，所述连接肽包括但不限于GGGGS、GGGSGGSG、GGGGGGGG、GGSGGSGGSGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、GSGGGSGGGGSGGGGS。

优选的，所述连接肽为GGGGS。

在一种实施方式中，在肝素裂解酶I的N端插入序列，所述序列包括bltD、cspB、C4、yxjG、ydbD、valS、tufA、ybdD、yvyD或glnA，所述序列的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5～14所示。

优选的，所述序列为yvyD、lnA、ydbD或tufA。