[发明专利]具有滑膜炎症抑制功能的纳米材料的制备方法及应用

说明书

本发明公开了具有滑膜炎症抑制功能的纳米材料的制备方法及应用，属于生物技术领域，其技术方案要点是：包括如下步骤：S1、shRNA‑LeptinR的构建：将合成的shRNA‑LeptinR片段插入到质粒载体中获得重组质粒载体，然后再将所述重组质粒载体载体转化到大肠杆菌中，并提取获得shRNA‑LeptinR质粒；S2、巨噬细胞膜制备；S3、载基因纳米粒M2H@RPK的制备，采用静电吸附法制备纳米粒M2H@RPK；以S2步骤中所提取的M2巨噬细胞膜包裹纳米粒H@RPK，采用微型挤出器反复过聚碳酸酯膜得纳米粒M2H@RPK。本发明主要用于减轻OA过程中的炎症级联反应，并且该纳米体系靶向软骨基质，能够有效减轻关节损伤和抑制整体关节炎严重性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及具有滑膜炎症抑制功能的纳米材料的制备方法及应用。

背景技术

越来越多地证据表明骨关节炎(OA)是一种与炎症相关的免疫性疾病，关节滑膜在其中扮演重要角色。关节滑膜可分为两层，即较薄而靠近关节腔的滑膜内层和滑膜下层，表层有2-3层细胞，在电镜下可确认出两种细胞，但两者之间无明显界线，它们是巨噬细胞样滑膜细胞和成纤维样滑膜细胞。

滑膜炎过程中，巨噬细胞的数量急剧增加。这种大量增长一部分来源于滑膜中原有的巨噬细胞逃避凋亡路径，但更多的来自于血液循环时浸润的巨噬细胞。巨噬细胞是一种高度可变的细胞，应答于其所在微环境的不同，主要有两种极化形式，M1型和M2型，M1型巨噬细胞是骨关节炎炎症因子产生、软骨降解、骨赘形成的主要巨噬细胞亚群，而M2型巨噬细胞通过分泌抗炎因子，对骨关节炎具有保护作用。

滑膜可大量分泌瘦素(leptin)，其表达水平与OA的进展和严重程度显著相关，Leptin通过其受体LeptinR发挥调节作用，并通过诱导单核或巨噬细胞增殖和活化从而参与自身免疫炎症反应，因此，靶向调控leptin信号为OA治疗提供了潜在的免疫途径。

目前OA是世界范围内老年人群中最普遍存在的关节疾病，OA已成为影响老年人群生活质量的重要病因，该疾病的主要临床表现为疼痛及功能逐渐丧失，并且目前的治疗手段具有一定的局限性。

为了解决上述问题，在现有技术的基础上，本发明提出具有滑膜炎症抑制功能的纳米材料的制备方法及应用。

发明内容

本发明的目的是提供具有滑膜炎症抑制功能的纳米材料的制备方法，本发明通过构建搭载巨噬细胞膜包裹的shRNA-leptinR(Ob-Rb)纳米体系，该纳米体系靶向软骨基质，能够有效减轻关节损伤和抑制整体关节炎严重性。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

具有滑膜炎症抑制功能的纳米材料的制备方法，包括如下步骤：

S1、shRNA-LeptinR质粒的构建：将合成的shRNA-LeptinR片段插入到质粒载体中获得重组质粒载体，然后再将所述重组质粒载体载体转化到大肠杆菌中，并提取获得shRNA-LeptinR质粒。

S2、巨噬细胞膜制备：

A.取对数生长期的M0型小鼠单核巨噬细胞白血病细胞，待密度达到70％时，加入IL-4和IL-13，作用24h后，收集M2型巨噬细胞。

B.采用预冷的Tris-镁盐缓冲盐重悬细胞，然后通过微型挤出器反复挤出20次以破坏细胞，再采用蔗糖梯度离心法提取细胞膜。

S3、载基因纳米粒M2H@RPK的制备，采用静电吸附法制备纳米粒M2H@RPK，其具体步骤为：

a.将S1步骤中shRNA-LeptinR质粒与iRGD混合，静置5min，形成iRGD与shRNA-LeptinR质粒的共混物；再加入PEI和抗炎肽KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA(KAFAK)，得到复合物RPK(KAFAK-iRGD-PEI-shRNA-LeptinR)，静置混合5min。