[发明专利]甲型流感病毒全基因组扩增试剂盒及扩增方法和应用

说明书

本发明提供一种甲型流感病毒全基因组扩增试剂盒及扩增方法和应用,配合由多个特异性逆转录引物组成的优化设计的特异性逆转录引物池，利用引入酶切位点进而可以进行双酶切，对甲型流感病毒进行逆转录和扩增，使扩增产物可适用于一代测序；也可以进行二代打断后测序，当然也可以应用三代连接法或快速法测序，也可适用于不同型别的甲型流感病毒的测序。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种甲型流感病毒全基因组扩增试剂盒及扩增方法和应用。

背景技术

流感病毒根据核蛋白(NP)和基质蛋白(M)不同分为A型、B型、C型，其中A型流感病毒(influenza A virus)也称为甲型流感病毒。甲型流感病毒为单股负链RNA病毒，基因组由8条负链RNA片段构成。甲型流感病毒为常见流感病毒，根据H和N抗原不同，甲型流感病毒又可以分为许多不同亚型(18种已知的HA压型和11种已知的NA亚型)，除去H17N10和H18N11亚型以外，其他甲型流感病毒均可感染禽类，而其中H5/H7/H9亚型还会引起人类感染，且此类病毒的易感性极高。病人自发病后5天内均可从鼻涕、口涎、痰液等分泌物排出病毒，排出的病毒以空气飞沫传播、污染物品接触的方式在人群中快速传染，对于预防病毒大规模传染而言，如何快速准确地对甲型流感病毒进行检测有非常重要的意义。

目前常见病毒检测的手段主要有：病毒分离、病毒形态学鉴定、血清学检测技术、核酸检测以及全基因组测序。其中全基因组测序相比其他检测手段而言，具有检测准确度高、其能够对样本病毒进行溯源及变异分析的优势。换言之，全基因组测序技术能够获取病毒的全基因组，进而从根源上识别和分析病毒。然而，由于甲型流感病毒存在多种亚型，且甲型流感病毒的变异速度极快，导致一代测序技术使用的特异引物往往不能扩增出变异的病毒，进而影响了测序的准确度；二代测序技术需要高通量的样本，且测序结束后下机依旧需要分析存在成本效益和时间效益相对高昂的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甲型流感病毒全基因组扩增试剂盒及扩增方法和应用,靶向获取流感病毒全基因序列，适用于不同型别的甲型流感病毒的测序，且获取的有效基因组片段可用于一代测序平台、二代短读长测序平台、三代长度长测序平台及其他分子学相关实验或检测。

本方案提供一种甲型流感病毒全基因组扩增试剂盒，且提供一种利用该甲型流感病毒全基因组扩增试剂盒进行扩增的扩增方法，扩增得到的有效基因组片段可适用于一代测序、二代测序、三代测序平台的检测，解决现有技术甲型流感病毒测序时存在的问题。

本方案通过甲型流感病毒8个片段启动子茎环结构打开后产生的首尾共保守序列，引入适当酶切位点、引物GC含量比、引物优化组合及PCR程序调整，采用高热稳定性、高效反转录酶(RT)与优化设计的病毒基因保守特异引物，可从经纯化的总RNA中一致且快速的合成cDNA，其中病毒基因保守特异引物为前序设计的引物优化组合，也可定义为逆转录特异性引物，随后，使用PCR引物扩增池内的引物与高保真酶对甲型流感病毒核酸进行全基因组靶向扩增，确保扩增产物的高效性与保真性。

值得说明的是，本方案选用酶切位点时需根据不同限制性酶而确定，不同限制性酶对应的酶切位点不同，需要作用的时间也有差异，酶切效率也不同，此处要综合考虑后续的逆转录方法和扩增体系等综合评估优化，才能得到合适的酶切位点。在本方案中，不同引物对应相同或不同的酶切位点，本方案选用的酶切位点为：ApaI(G↑GGCC↓C)和EcoR I(G↓AATT↑C)。

而不同引物GC含量比会导致聚合酶扩增下的效率有所差异，尤其是多重PCR，引物偏好严重，因此不同靶向扩增片段效率不同。本方案优选将引物GC含量比控制在40-60％，引物退火温度控制在55-70℃，并且考虑引物之间是否会自发连成发夹或茎环结构决定合适的引物GC含量比。