[发明专利]检测基因组编辑

说明书

提供方法、组合物和试剂盒，用于定量细胞基因组或细胞群的基因组中双链断裂的数量或频率。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年3月17日提交的美国临时申请62/134,517号的优先权，该文通过引用全文纳入本文用于所有目的。

背景技术

双链断裂点可以通过各种不同的机制在细胞的基因组中出现。例如，化学诱变剂，高强度磁场或电离辐射可引入双链断裂点。作为另一个实例，可以通过各种基因组编辑试剂或方法将双链断裂点引入基因组。

理想的基因组编辑试剂只会在基因组中的一个或多个“定靶”位点产生双链断裂点。然而，目前的基因组编辑试剂常在基因组中的一个或多个“脱靶”位点产生双链断点。在某些情况下，这种脱靶位点与定靶位点高度同源。对于已知序列并且具有少量高度同源的脱靶部位的基因组，可以使用任何数量的可用方法鉴定和测定这种高度同源的脱靶位点。然而，脱靶编辑的位置，数量和频率通常是不可预测的。此外，由化学诱变剂，高强度磁场或电离辐射引入的双链断裂本质上是不可预测的。

通过全基因组下一代测序可以确定细胞整个基因组中双链断裂的定性和定量。然而，这可能是相当昂贵和耗时的，并且对于测定细胞群(例如，从生物体的样品获得的细胞群)或用于优化基因组编辑试剂和方法来说是不切实际的。

发明内容

在第一方面，本发明提供定量细胞基因组中双链断裂点数量的方法，所述方法包括：a)从所述细胞提供基因组核酸，其中所述基因组核酸在细胞中的双链断点插入有外源供体多核苷酸或其部分；b)将基因组核酸片段化以产生多个基因组核酸片段，其中至少一个基因组核酸片段含有所述插入的供体多核苷酸或其部分；c)产生包含环状基因组核酸片段和扩增引物对的多个混合物分区，其中所述扩增引物对与供体多核苷酸或其部分的相反链互补，并且其中所述扩增引物对定向为使得，当在环化前与含有所述插入的供体多核苷酸或其部分的基因组核酸片段杂交时，5'端彼此接近并且3'端彼此远离；d)用该扩增引物对扩增基因组核酸片段，以选择性地在包括含有所述插入的供体多核苷酸或其部分的一个或多个基因组片段的混合物分区中产生扩增子；e)检测扩增子；和f)计数含扩增子的混合物分区的数量，从而定量细胞基因组中的双链断裂点的数量。

在第二方面，本发明提供检测或定量细胞基因组中双链断裂点数量的方法，所述方法包括：提供基因组核酸片段，其中所述基因组核酸片段的至少一部分包含插入的外源供体寡核苷酸；对片段分区；在适于选择性地扩增包括含插入的片段的分区的条件下孵育分区；检测分区中的选择性扩增产物；和定量其中检测到选择性扩增产物的分区的数量。

在一些实施方式中，生成包含循环基因组核酸片段的多个混合物分区包括使该基因组核酸片段环化，并将环化的基因组核酸片段划分成多个混合物分区。在一些实施方式中，生成包含循环基因组核酸片段的多个混合物分区包括将所述基因组核酸片段划分成多个混合物分区并使所述分区中的基因组片段环化。在一些实施方式中，所述方法还包括对细胞群进行a)-f)，从而定量细胞群的基因组中的双链断裂点的数量。在一些实施方式中，所述双链断点中的至少一个由外源基因组编辑试剂诱导。在一些实施方式中，所述双链断裂点中的至少一个由化学诱变剂或电离辐射诱导。

在一些实施方式中，供体多核苷酸是双链供体多核苷酸。在一些情况中，所述双链供体多核苷酸包含5'或3'硫代磷酸酯连接。在一些情况中，所述双链供体多核苷酸包含5'和3'硫代磷酸酯连接。在一些情况中，所述双链供体多核苷酸包含钝的5'和3'端。在一些情况中，所述双链供体多核苷酸是5’磷酸化的。在一些情况中，所述双链供体多核苷酸的长度为20-150bp。在一些情况中，所述双链供体多核苷酸的长度为25-50bp。在一些情况中，所述双链供体多核苷酸的长度为30-40bp。在一些情况中，双链供体多核苷酸的长度为34bp。