[发明专利]金属有机框架纳米酶应用于miRNA连续检测的均相检测方法

说明书

本发明公开了金属有机框架纳米酶应用于miRNA连续检测的均相检测方法，包括以下步骤：步骤1：DSN酶辅助信号扩增方案：为了形成发夹结构，发卡DNA被加热到95摄氏度5分钟，然后慢慢冷却到室温；步骤2：流动分析:采用流动‑间歇法对目标物进行流动分析，以间歇模式记录生物传感器的DPV响应，在流动模式下，用将DSN辅助信号放大的产品引入分析单元，并在30‑40℃下孵育，在流动模式下，在MOF/ITO电极上进行竞争洗脱，以cDNA为流动相，洗脱后，MOF/ITO电极作为工作电极在PBS缓冲液中进行电化学测量。本发明通过超声法简单合成具有仿酶活性二维MOF纳米酶，并将纳米酶应用于生物传感器，无需复杂的电极修饰过程，构建了高选择性，高灵敏度的电化学生传感器。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及金属有机框架纳米酶应用于miRNA连续检测的均相检测方法。

背景技术

基于DNA的均相分析是指在均质溶液中进行的整个传感过程，与目标识别与耗时费力的传统非均相分析方法相比，均相分析方法简单、易于操作、快速，不需要固定和洗涤步骤。在电化学测试系统中具有很大的优势。

纳米酶是指具有酶样性质的纳米材料，因其突出的优点而成为研究热点，在生物传感和免疫分析领域显示出广泛的应用。其中，三维金属有机框架(MOF)纳米酶在近十年来得到了迅速的发展。与3D体块MOF纳米酶相比，2DMOF纳米酶由于具有更大的表面积和更容易接近的活性位点以及更小的底物分子的扩散屏障，近年来受到越来越多的研究关注，二维MOF纳米片的制备方法有溶剂热法、表面活性剂辅助合成和超声剥离等。与溶剂热法和表面活性剂辅助合成法对实验安全性和人员技能要求较高相比，超声法简单易行。

均相DNA电化学试验一般在静态条件下进行，而均相电化学在动态流动条件下更有优势。流动系统能够实时更新相界面，既保证了试验的重现性，又能实现快速测定。均相电化学在流动条件下循环试验中的应用迄今尚未见报道。

发明内容

1.要解决的技术问题

本发明的目的是为了解决现有技术中均相电化学在流动条件下循环试验中的应用迄今尚未见报道的问题，而提出的金属有机框架纳米酶应用于miRNA连续检测的均相检测方法。

2.技术方案

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

金属有机框架纳米酶应用于miRNA连续检测的均相检测方法，在均相溶液中采用双链特异性核酸酶辅助信号放大策略实现了信号放大，利用金属有机框架纳米酶的单链DNA吸附能力对单链DNA进行富集，并利用金属有机框架纳米酶的仿过氧化物酶活性实现信号的进一步放大，结合流动注射-间歇法实现了金属有机框架修饰的氧化铟锡电极的循环利用和目标物miRNA的连续检测，从而实现了对miRNA的连续均相检测；包括以下步骤：

步骤1：双链特异性核酸酶辅助信号扩增方案：亚甲基蓝标记的发卡DNA序列被加热到95摄氏度5分钟，然后慢慢冷却到室温，形成发卡结构；在核酸扩增缓冲液中加入终浓度分别为0.15-0.5U和0.8-1.2μM的双链特异性核酸酶和上述发卡DNA，再加入待测miRNA样品，在45-60℃下孵育50-70min；然后将双链特异性核酸酶终止液加入上述溶液中终止信号扩增反应。

步骤2：采用流动注射-间歇法对目标物miRNA进行连续检测：在流动模式下，将步骤1中的溶液通过流动注射注入电化学分析池，并在间歇模式下孵育30-60分钟；然后通过流动注射法在电化学分析池内注入含有过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液；在间歇模式下利用三电极体系进行差分脉冲伏安法或线性伏安法或阻抗法检测，并得到电化学信号，根据电化学信号与miRNA的浓度的关系求得待测物浓度。

步骤3：在流动模式下，以互补DNA(cDNA)为流动相对金属有机框架纳米酶修饰的氧化铟锡电极的DNA进行竞争洗脱；完成后，重复步骤1-3以进行下一轮miRNA检测。