[发明专利]金属有机框架纳米酶应用于miRNA连续检测的均相检测方法

权利要求书

1.金属有机框架纳米酶应用于miRNA连续检测的均相检测方法，其特征在于，在均相溶液中采用双链特异性核酸酶辅助信号放大策略实现了信号放大，利用金属有机框架纳米酶的单链DNA吸附能力对单链DNA进行富集，并利用金属有机框架纳米酶的仿过氧化物酶活性实现信号的进一步放大，结合流动注射-间歇法实现了金属有机框架修饰的氧化铟锡电极的循环利用和目标物miRNA的连续检测，从而实现了对miRNA的连续均相检测；包括以下步骤：

步骤1：双链特异性核酸酶辅助信号扩增方案：亚甲基蓝标记的发卡DNA序列被加热到95摄氏度5分钟，然后慢慢冷却到室温，形成发卡结构；在核酸扩增缓冲液中加入终浓度分别为0.15-0.5U和0.8-1.2μM的双链特异性核酸酶和上述发卡DNA，再加入待测miRNA样品，在45-60℃下孵育50-70min；然后将双链特异性核酸酶终止液加入上述溶液中终止信号扩增反应。

步骤2：采用流动注射-间歇法对目标物miRNA进行连续检测：在流动模式下，将步骤1中的溶液通过流动注射注入电化学分析池，并在间歇模式下孵育30-60分钟；然后通过流动注射法在电化学分析池内注入含有过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液；在间歇模式下利用三电极体系进行差分脉冲伏安法或线性伏安法或阻抗法检测，并得到电化学信号，根据电化学信号与miRNA的浓度的关系求得待测物浓度。

步骤3：在流动模式下，以互补DNA(cDNA)为流动相对金属有机框架纳米酶修饰的氧化铟锡电极的DNA进行竞争洗脱；完成后，重复步骤1-3以进行下一轮miRNA检测。

2.根据权利要求1所述的金属有机框架纳米酶应用于miRNA连续检测的均相检测方法，其特征在于，所述核酸扩增缓冲液包括pH＝8.0的50mM的Tris-HCl、5mM的氯化镁(MgCl₂)、1mM的二硫苏糖醇(DTT)，所述DSN终止溶液为10mM的乙二胺四乙酸(EDTA)。

3.根据权利要求1所述的金属有机框架纳米酶应用于miRNA连续检测的均相检测方法，其特征在于，所述步骤2中氧化铟锡(ITO)电极使用前先用丙酮、无水乙醇和大量去离子水依次洗涤，然后用N₂吹干，然后将清洗的氧化铟锡电极浸没在金属有机框架纳米酶乙醇分散液(1mg/mL)中，重复浸没数次后取出后自然干燥以得到金属有机框架纳米酶修饰的氧化铟锡电极.

4.根据权利要求1所述的金属有机框架纳米酶应用于miRNA连续检测的均相检测方法，其特征在于，所述步骤2中电化学分析池为聚四氟乙烯池或者聚丙烯池或者玻璃池；所述步骤2中三电极体系是由铂丝作对电极，饱和银/氯化银作参比电极，金属有机框架纳米酶修饰的氧化铟锡电极作工作电极组成。

5.根据权利要求1所述的金属有机框架纳米酶应用于miRNA连续检测的均相检测方法，其特征在于，所述步骤2中差分脉冲伏安法(DPV)在间歇模式下的检测条件为：在含有1.5mMH₂O₂的pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中进行扫描，其扫描范围为0V～-0.4V，扫描速率为100mV；线性伏安法在间歇模式下的检测条件为：在含有1.5mM H₂O₂的pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中进行扫描，扫描范围为0V～-0.4V,扫描速率为100mV；阻抗法检测条件为：在铁氰化钾溶液中进行，扫描范围为0.1Hz～10000Hz,振幅为5mV。

6.根据权利要求1所述的金属有机框架纳米酶应用于miRNA连续检测的均相检测方法，其特征在于，所述步骤1-3中注射泵流速独立为10-40μL/min，持续时间独立为25-60min。

7.根据权利要求1所述的金属有机框架纳米酶应用于miRNA连续检测的均相检测方法，其特征在于，所述步骤2和3中，二维金属有机框架纳米酶的合成采用超声波法制备复合材料，首先将对苯二甲酸(0.75mmol)和金属离子盐(六水合氯化钴、氯化锰或氯化铁，0.375mmol)溶于含有二甲基甲酰胺(32mL)、乙醇(2mL)和水(2mL)的50mL试管中，超声处理，随后，将0.8mL三乙胺快速注入上述溶液中，搅拌5min，得到胶体悬浮液，超声处理8h(40kHz)，离心，乙醇洗涤3次，真空干燥，最后，获得金属有机框架纳米酶粉末，并在4摄氏度下存储。