[发明专利]一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒及使用方法

说明书

本发明的一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒及使用方法，包括肠道病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液。其中，肠道病毒反应液中含有荧光标记的探针、引物、酶混合物、增强剂、冻干保护剂、10xbuffer、核苷酸混合物等，可以在同一反应体系中检测是否感染肠道病毒。通过内源性内参对样本采集、核酸提取、扩增和检测整个过程进行监控，避免因假阴性结果而导致的误判。探针为包括荧光报告基团和淬灭基团的寡核苷酸。当探针完整时，由于淬灭基团空间位置上靠近报告基团从而抑制报告基团发出荧光。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5’→3’外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号，从而实现对肠道病毒在核酸水平上的检测。

技术领域

本发明涉及肠道病毒核酸检测技术领域，尤指一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒及使用方法。

背景技术

肠道病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，能引起人类致病的肠道病毒有多种，引起的主要疾病有手足口病、无菌性脑膜炎等。手足口病5岁以下儿童为主，尤以3岁以下儿童发病率最高，该病流行无明显的地区性，全年均可发生，一般5-7月为发病高峰。引起手足口病的肠道病毒包括柯萨奇病毒A组的2、4、5、6、7、9、10、16型等，B组的1、2、3、4、5型等，肠道病毒71型及埃可病毒等。由于这些病毒引起的症状和流行特点相似，仅靠临床症状对病原进行区分非常不可靠，实验室诊断方法有病毒分离、抗原检测与核酸检测等。

经过检索，中国发明专利：一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒及其检测方法(申请号为201010105091.7，申请日为2010.02.02)，该申请案试剂盒含有：PCR反应酶，其中包括热启动Taq酶、MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂；PCR反应液，其中包括DEPC处理水、dNTPs、10×PCRBuffer、肠道病毒通用型正向引物、肠道病毒通用型反向引物、肠道病毒通用型探针；肠道病毒通用型正向引物序列为：5’-CTAGGGTGTCCGTGTATCC-3’，肠道病毒通用型反向引物序列为：5’-GGCCTATCCAATAGCTATATCG-3’，肠道病毒通用型探针序列为：5’-AATTCTTTAATTGTGACCATAAGCAGCGAATA-3’；阴性质控品，为DEPC处理水；阳性质控品，为制备的体外转录RNA。采用实时荧光定量PCR技术检测总肠道病毒核酸序列的方法，具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点。但是该申请案的不足之处在于没有设置内参，对于反应的质量难以把控。

发明内容

本发明提供一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒及使用方法，解决现有的肠道病毒核酸检测试剂盒没有设置内参，对于反应的质量难以把控的问题。

本发明提供的技术方案如下：一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒，包括肠道病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液。

优选地，所述肠道病毒反应液包括酶混合物、核苷酸混合液、10xBuffer、增强剂、冻干保护剂、肠道病毒通用型上游引物、肠道病毒通用型下游引物、肠道病毒通用型探针、内参β-actin上游引物、内参β-actin下游引物和内参β-actin探针。

优选地，所述阳性对照液为肠道病毒通用型病毒样颗粒、内参β-actin病毒样颗粒的混合液，所述阴性对照液为0.9％的氯化钠溶液。

优选地，所述肠道病毒通用型上游引物序列为CTAGGGTGTCCGTGTATCC；

所述肠道病毒通用型下游引物序列为GGCCTATCCAATAGCTATATCG；

所述肠道病毒通用型探针序列为：

AATTCTTTAATTGTGACCATAAGCAGCGAATA。

优选地，所述肠道病毒通用型上游引物序列中的第8位碱基G为锁核酸修饰碱；