[发明专利]对目标核酸进行检测的方法

说明书

本发明涉及对目标核酸进行检测的方法，其一个实施方式具备制备混合液的工序、对混合液的荧光强度进行测定的工序、和基于荧光强度、对目标核酸进行检测的工序。目标核酸的探针结合区域的至少一个末端为鸟嘌呤碱基、且在距离该鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的探针结合区域存在1个以上的胞嘧啶碱基。核酸探针与目标核酸杂交。核酸探针具备末端具有与该鸟嘌呤碱基相对的胞嘧啶碱基的寡核苷酸和结合于该胞嘧啶碱基的荧光色素。通过使该胞嘧啶碱基中与最接近末端鸟嘌呤碱基的胞嘧啶碱基相对的寡核苷酸上的碱基为不具有荧光色素的荧光的消光作用的碱基，和所述碱基为鸟嘌呤碱基的情况相比，不与靶核酸杂交时的荧光强度的减少较小。

本申请是申请日为2017年2月6日、优先权日为2016年2月9日、中国专利申请号为201780008629.2、发明名称为“对目标核酸进行检测的方法及该方法中使用的核酸探针”的分案申请。

技术领域

本发明涉及对目标核酸进行检测的方法及该方法中使用的核酸探针。

背景技术

作为核酸的检测方法之一，可举出荧光标记探针法(参照下述专利文献1)。该方法中使用的探针例如有具备荧光色素及具有使荧光色素产生的荧光消光的作用(也称作“消光作用”)的消光分子按照相邻的方式结合的单链寡核苷酸的核酸探针。该核酸探针是按照与作为目标的核酸(以下称作“目标核酸”)杂交的方式设计的。在聚合酶链反应(以下也称作“PCR”)中，当上述核酸探针与目标核酸杂交、进而核酸探针被具有核酸酶活性的聚合酶分解时，消光分子会自荧光色素离去，因此荧光色素的荧光强度增加。在使用上述具有单链寡核苷酸的核酸探针的方法中，通过核酸探针分解前后的荧光强度或荧光波长的变化，对目标核酸进行检测。

在荧光标记探针法使用的探针中有具有长度不同的2条寡核苷酸的核酸探针(参照下述专利文献2-3)。该核酸探针中，2条寡核苷酸具有相互间互补的碱基序列，将荧光色素结合在一条寡核苷酸上、将具有使荧光色素产生的荧光消光的作用的消光分子结合在另一条寡核苷酸上。PCR中，在加热至高温时，上述2条寡核苷酸分离。与其相伴，消光分子自荧光色素离去，因此荧光强度增加。接着，当降低温度时，较长的寡核苷酸与目标核酸杂交，持续观测到荧光色素产生的荧光。另一方面，在不存在目标核酸的情况下，当降低温度时，上述2条寡核苷酸相互间杂交，消光分子靠近荧光色素，因此荧光色素产生的荧光发生消光。在使用具有上述2条寡核苷酸的核酸探针的方法中，通过测定PCR退火阶段的荧光强度，对目标核酸进行检测。

荧光标记探针法中使用的探针中，还有被靠近鸟嘌呤碱基时、荧光强度减少的(也称作“消光”)荧光色素标记的Quenching Probe(以下称作“QProbe”)(参照下述专利文献4)。该QProbe按照在末端具有结合有上述荧光色素的胞嘧啶碱基、当QProbe与目标核酸杂交时、胞嘧啶碱基与目标核酸中的鸟嘌呤碱基形成碱基对、将鸟嘌呤碱基配置于荧光色素附近的方式设计。因此，当QProbe与目标核酸杂交时，荧光色素由于配置在鸟嘌呤碱基的附近，因此发生消光。使用QProbe的核酸的检测方法中，利用杂交前后的荧光强度的减少量，对目标核酸进行定量。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表平6-500021号公报

专利文献2：日本特开平10-262700号公报

专利文献3：日本特表2004-511227号公报

专利文献4：日本特开2001-286300号公报

发明内容

发明欲解决的技术问题

但是，使用专利文献1～3中记载的核酸探针对目标核酸进行检测时，检测等需要昂贵的精密机器，费用高。此外，使用了专利文献1-3中记载的核酸探针的目标核酸的检测的工序数多、复杂，检测需要熟练。