[发明专利]DKK-3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了DKK‑3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用，涉及基因甲基化技术领域。DKK‑3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用，DKK‑3基因甲基化诊断试剂体系，用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR，通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化，反之，说明被检测的位点不存在甲基化，该DKK‑3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用，敏感性高，待测DNA中5‑甲基胞嘧啶分布极不均衡也可检测。适用于各种样本类型。转化效率高，在3小时内完成富含GC的DNA的完全转化。

技术领域

本发明涉及基因甲基化技术领域，特别涉及DKK-3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用。

背景技术

DNA甲基化是基因表达调控的一种重要机制，DNA甲基化检测是指利用各种方法对肿瘤细胞DNA甲基化程度进行测定。在恶性肿瘤的发展中，甲基化的状态并不是一成不变，肿瘤细胞内全基因组的低甲基化程度与疾病进展、肿瘤大小和恶性程度都有密切的关系，DNA甲基化检测对肿瘤恶性程度的判断有重要意义。

现有的DKK-3基因甲基化诊断试剂盒无法达到敏感性高以及转换效率高，因此我们提出了DKK-3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用。

发明内容

本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供DKK-3 基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：DKK-3基因甲基化诊断试剂体系，用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR，通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化，反之，说明被检测的位点不存在甲基化。

亚硫酸氢盐测序法

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化，将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率。

高分辨率熔解曲线法

在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛，若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。

许多基因，尤其是管家基因的启动子区，其中通常存在一些富含双核苷酸“CG”的区域，称为“CpG岛”(CpGisland)。研究碱基G和C在整个基因组内的含量和分布有十分重要的意义。例如在人类基因组内，GC的含量大约为40％；这些GC并不是平均分布在基因组内，在某些DNA片段上其含量可高达60％以上，而在另一些区域则只有33％左右。这种GC含量的差别，在基因表达的调控和基因突变上都可能扮演着重要的角色。在人类基因组内，存在有近3万个CpG岛；在大多数染色体上，平均每100万碱基含有5～15个 CpG岛，其中有1.8万多个CpG岛片段的GC含量为60％～70％。通常，这些CpG 岛不仅是基因的一种标志，而且还参与基因表达的调控和影响染色质的结构。例如，除定位于失活X染色体上的基因、印迹基因和非表达的组织特异基因 (奢侈基因)外，正常细胞的CpG岛由于被保护而处于非甲基化状态。