[发明专利]多肽微阵列芯片在血浆中检测凝血酶活性及筛选凝血酶抑制剂的方法

说明书

本发明公开了多肽微阵列芯片在血浆中检测凝血酶活性及筛选凝血酶抑制剂的方法，涉及多肽微阵列芯片技术领域。该多肽微阵列芯片在血浆中检测凝血酶活性，S1：将多肽微阵列芯片与激活的血浆在一起放置反应，反应的温度保持在三十度到三十六度之间，反应时间保持在一小时以上，S2：抑制剂检测将不同浓度的抑制剂分别与凝血酶溶液(30U/mL)、加标血清(含30U/mL凝血酶)或血浆混合,血清或血浆的使用浓度为33%,将混合溶液与芯片37°C反应1h，依次用含0.1%(V/V)Triton X‑100的洗涤液‑I、洗涤液‑II和超纯水洗涤芯片3次，旋干。

技术领域

本发明涉及多肽微阵列芯片技术领域，特别涉及多肽微阵列芯片在血浆中检测凝血酶活性及筛选凝血酶抑制剂的方法。

背景技术

微阵列生物芯片技术可以在一张芯片上集成多种生物化学反应，能够实现对生物活性物质高效快速地测试和分析。固定蛋白酶或蛋白酶特异底物的微阵列芯片可以同时分析多种抑制剂与蛋白酶之间的作用机理和作用效率 8.01。Ottamchandani等用蛋白微阵列芯片同时检测了3种化合物对4种半胱氨酸蛋白酶的抑制效率10；Neumann等用小分子微阵列芯片从近10万个有机小分子中筛选出了6种能与凝血酶活性位点结合的化合物”。

现有的筛选凝血酶抑制剂的方法一般只能,本方法不仅可以在酶溶液中，进行计算，因此我们提出了一种多肽微阵列芯片在血浆中检测凝血酶活性及筛选凝血酶抑制剂的方法。

发明内容

本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供多肽微阵列芯片在血浆中检测凝血酶活性及筛选凝血酶抑制剂的方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：多肽微阵列芯片在血浆中检测凝血酶活性

S1：将多肽微阵列芯片与激活的血浆在一起放置反应，反应的温度保持在三十度到三十六度之间，反应时间保持在一小时以上；

S2：抑制剂检测将不同浓度的抑制剂分别与凝血酶溶液(30U/mL)、加标血清(含30U/mL凝血酶)或血浆混合,血清或血浆的使用浓度为33％,将混合溶液与芯片37℃反应1h，依次用含0.1％(V/V)Triton X-100的洗涤液-I、洗涤液-II和超纯水洗涤芯片3次，旋干；

S3：酶水解过程识别用3μmol/L荧光素标记的亲和素与芯片37℃反应1h，依次用含1％(V/V)Tween-20不含BSA的洗涤液-1、不含BSA的洗涤液-I和超纯水洗涤芯片3次,旋干，用扫描仪进行扫描，用0.3nmol/L金纳米粒子与芯片37度反应1h；

S4：用酶反应缓冲液(pH 7.35,20mmol/L HEPES,0.14mol/L NaCl,2 mmol/LCaCI2)配制30U/ml凝血酶溶液,与芯片37℃反应1h，依次用含 0.1％(V/V).Triton X-100的洗涤液-II(pH 7.5,20mmol/LTris,2mmol/L EDTA,0.15mol/L NaCI)、洗涤液II和超纯水洗涤芯片3次，然后旋干。

多肽微阵列芯片在血浆中筛选凝血酶抑制剂的方法

S1：血液样品制备血液采集后6h内离心分离血浆,并速冻制成新鲜冰冻血浆,-80℃保存，用血浆稀释缓冲液(pH 7.35,20mmol/L HEPES,21.7 mmol/L柠檬酸钠60g/L BSA)将40μL血浆稀释1倍,加入20μL的激活剂 (30pmol/L重组人组织因子和24μmol/L磷脂混合物(磷脂酰丝氨酸:磷脂酰乙醇胺:磷脂酰胆碱＝1:1:3,摩尔比),37℃孵育5min，加入20μLHEPES缓冲液(pH 7.35,20mmol/L HEPES,60g/L BSA,0.1mol/L CaCl2),制成活化的血浆，将活化血浆1300g离心10min,分离得到血清。