[发明专利]多肽微阵列芯片在血浆中检测凝血酶活性及筛选凝血酶抑制剂的方法

权利要求书

1.多肽微阵列芯片在血浆中检测凝血酶活性，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将多肽微阵列芯片与激活的血浆在一起放置反应，反应的温度保持在三十度到三十六度之间，反应时间保持在一小时以上；

S2：抑制剂检测将不同浓度的抑制剂分别与凝血酶溶液(30U/mL)、加标血清(含30U/mL凝血酶)或血浆混合,血清或血浆的使用浓度为33％,将混合溶液与芯片37℃反应1h，依次用含0.1％(V/V)Triton X-100的洗涤液-I、洗涤液-II和超纯水洗涤芯片3次，旋干；

S3：酶水解过程识别用3μmol/L荧光素标记的亲和素与芯片37℃反应1h，依次用含1％(V/V)Tween-20不含BSA的洗涤液-1、不含BSA的洗涤液-I和超纯水洗涤芯片3次,旋干，用扫描仪进行扫描，用0.3nmol/L金纳米粒子与芯片37度反应1h；

S4：用酶反应缓冲液(pH 7.35,20mmol/L HEPES,0.14mol/L NaCl,2mmol/L CaCI2)配制30U/ml凝血酶溶液,与芯片37℃反应1h，依次用含0.1％(V/V).Triton X-100的洗涤液-II(pH 7.5,20mmol/LTris,2mmol/LEDTA,0.15mol/L NaCI)、洗涤液II和超纯水洗涤芯片3次，然后旋干。

2.多肽微阵列芯片在血浆中筛选凝血酶抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：血液样品制备血液采集后6h内离心分离血浆,并速冻制成新鲜冰冻血浆,-80℃保存，用血浆稀释缓冲液(pH 7.35,20mmol/L HEPES,21.7mmol/L柠檬酸钠60g/L BSA)将40μL血浆稀释1倍,加入20μL的激活剂(30pmol/L重组人组织因子和24μmol/L磷脂混合物(磷脂酰丝氨酸:磷脂酰乙醇胺:磷脂酰胆碱＝1:1:3,摩尔比),37℃孵育5min，加入20μL HEPES缓冲液(pH 7.35,20mmol/L HEPES,60g/L BSA,0.1mol/L CaCl2),制成活化的血浆，将活化血浆1300g离心10min,分离得到血清。

S2：金纳米粒子探针制备100mL超纯水中加入2mL1％氯金酸溶液，加热至沸，加入2mL2％柠檬酸钠溶液继续加热搅拌30min,合成30nm粒径的金纳米粒子，取120μL 1g/L CALNN-CALNNGK(biotin)G混合液(9:1,V/V)，加入10mL.4nmol/L金纳米粒子溶液中，室温静置1h，离心除去上清液,重悬于探针缓冲液(pH 7.5,50mmol/L磷酸盐溶液,0.15mol/L NaCI,0.1％(V/V)吐温-20,1％(w0/V)BSA),4℃储存；

S3：多肽微阵列芯片制备和酶水解过程用点样缓冲液(pH 8.5,0.3mol/L磷酸盐,0.2mol/LNaCl,35％(V/V)甘油,0.002％(20/V)BSA)配制0.5g/L多肽(CAEGGfPRSFRVVK(biotin))溶液,使用晶芯微阵列芯片点样系统点样于光学级三维高分子D基片上,30℃反应14h，芯片表面的醛基基团与多肽N末端半胱氨酸残基上的氨基和巯基基团共价反应形成五元环结构，使多肽固定于芯片表面，用含0.1％(V/V)吐温-20的洗涤液-1(pH7.5,50mmol/I.磷酸盐,1％(10/V)BSA)洗涤2次，放入封闭液(pH 7.5,50mmol/L磷酸盐,0.15mol/LNaCl,1％(w/V)BSA,0.1mol/L乙醇胺)309C反应1h，用超纯水洗涤3次,旋干(480g,1min)，用酶反应缓冲液(pH 7.35,20mmol/L HEPES,0.14mol/L NaCl,2mmol/L CaCI2)配制30U/mL凝

血酶溶液,与芯片37℃反应1h；依次用含0.1％(V/V).Triton X-100的洗涤液-II(pH7.5,20mmol/LTris,2mmol/LEDTA,0.15mol/L NaCI)、洗涤液II和超纯水洗涤芯片3次,旋干。

S4：将不同浓度的抑制剂分别与凝血酶溶液(30U/mL)、加标血清(含30U/mL凝血酶)或血浆混合,血清或血浆的使用浓度为33％,将混合溶液与芯片37℃反应1h，依次用含0.1％(V/V)Triton X-100的洗涤液-I、洗涤液-II和超纯水洗涤芯片3次，旋干；

S5:信号检测和数据分析用芯片扫描仪提取共振光散射信号,所有数据都为扣除背景后的信号值，用6个相同点的信号值计算平均值和标准偏差,抑制剂检测中,不加抑制剂的子阵列作为阴性对照,定义为最小信号值1mm；不加凝血酶的子阵列作为阳性对照，定义为最大信号值mn。子阵列的相对信号强度用公式(1)计算:△I＝(I-Imin)/(Imax-Imin)x100％其中,I为同时加入凝血酶和抑制剂的子阵列的信号值。