[发明专利]一种筛查红系转录因子EKLF基因突变的方法及其应用

说明书

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种筛查红系转录因子EKLF基因突变的方法及其应用。其特点是根据EKLF基因序列设计扩增引物，利用优化的高分辨率熔解曲线反应体系针对样本中EKLF基因未知突变进行筛查。本发明提供的检测方法操作简单、速度快、通量高、PCR产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异、真正实现闭管操作，具有广阔的临床应用前景。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种筛查红系转录因子EKLF基因突变的方法及其应用。

背景技术

红系转录因子EKLF/KLF1最早由美国西奈山医学院科学家Bieker发现，它通过特异性的识别结合保守的DNA序列启动下游基因的转录从而调节红细胞一系列的生长发育过程。EKLF基因（NC_000019.10）位于19p13.2，全长2781bp，含有三个外显子，两个内含子，蛋白由2个功能域组成：一个位于N端，是由脯氨酸富集的转录激活结构域；另一个位于C端，是结合保守DNA序列的锌指结构域。研究显示EKLF基因显性突变或双重突变可导致一系列血液病表型，而EKLF基因单等位基因的突变可以导致一系列的良性表型，如胎儿血红蛋白HbF和成人血红蛋白A2（HbA2）升高等，进而对b-地中海贫血临床表型产生表型修饰作用。

筛查基因未知突变的方法主要有变性高效液相色谱（DHPLC），单链构象多态性（SSCP），Sanger测序法（金标准）以及下一代测序等。但是这些检测方法或多或少的存在操作步骤繁琐，检测周期长，检测成本较高等缺点。高分辨率熔解曲线（High resolutionmeltinganalysis，HRM）技术是一种可以实现高通量并获得可靠结果的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。HRM筛查突变的主要原理是根据不同核酸分子的片段长短、GC含量、碱基互补配对存在差异性，使得PCR产物在加热变性时，即使单个碱基的变化足以影响片段使解链温度（Tm值）存在差异，双链DNA分子同时形成独特的熔解曲线的形状和位置，从而根据熔解曲线的不同来对样品进行区分，最终对筛查出的突变的阳性样本进行Sanger测序确认。

因此应用HRM筛查EKLF基因突变具有重要的应用价值，目前筛查方法最常见是Sanger测序法，实验分步进行，所需配备试剂复杂，耗时耗力，经济成本高，容易污染，不适用于大规模人群筛查，所以探索一种适用大规模人群筛查EKLF基因突变的方法及检测试剂盒已经成为临床实验研究的热点问题。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种应用HRM技术检测EKLF基因未知突变的检测试剂盒，以解决上述背景技术中提出的目前检测使用的试剂原料需多方配备，实验操作步骤繁琐，耗时较长，容易污染，检测成本较高等问题。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。

本发明提供一种以高分辨率熔解曲线技术为基础检测EKLF基因突变的PCR引物组，其特征在于，所述引物组包括9对引物，详述如下：

（1）EKLF基因启动子区域上下游引物分别为：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；

（2）EKLF基因外显子1区域上下游引物分别为：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；

（3）EKLF基因外显子2-1区域上下游引物分别为：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；

（4）EKLF基因外显子2-2区域上下游引物分别为：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；

（5）EKLF基因外显子2-3区域上下游引物分别为：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；

（6）EKLF基因外显子2-4区域上下游引物分别为：SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；

（7）EKLF基因外显子3区域上下游引物分别为：SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；

（8）EKLF基因3'UTR-1区域上下游引物分别为：SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；