[发明专利]一种筛查红系转录因子EKLF基因突变的方法及其应用

权利要求书

1.一种以高分辨率熔解曲线技术为基础检测EKLF基因突变的PCR引物组，其特征在于，所述引物组包括9对引物，详述如下：

（1）EKLF基因启动子区域上下游引物分别为：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；

（2）EKLF基因外显子1区域上下游引物分别为：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；

（3）EKLF基因外显子2-1区域上下游引物分别为：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；

（4）EKLF基因外显子2-2区域上下游引物分别为：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；

（5）EKLF基因外显子2-3区域上下游引物分别为：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；

（6）EKLF基因外显子2-4区域上下游引物分别为：SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；

（7）EKLF基因外显子3区域上下游引物分别为：SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；

（8）EKLF基因3'UTR-1区域上下游引物分别为：SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；

（9）EKLF基因3'UTR-2区域上下游引物分别为：SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18。

2.一种以高分辨率熔解曲线技术为基础检测EKLF基因突变的检测反应体系，其特征在于，所述反应体系含有权利要求1所述的一组或几组的PCR引物组。

3.根据权利要求2所述的检测反应体系，其特征在于，所述反应体系还包括阴性质控品、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、LC Green、Betain、去离子水和DMSO；所述dNTPs混合物包括dATP、dTTP、dGTP和dCTP。

4.根据权利要求3所述的检测反应体系，其特征在于，所述DNA聚合酶为广州鼎国生物Taq DNA聚合酶。

5.根据权利要求3所述的检测反应体系，其特征在于，所述Betain为5M。

6.一种以高分辨率熔解曲线技术为基础检测EKLF基因突变的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的一组或几组的PCR引物组。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含权利要求3所述的检测反应体系。

8.一种以高分辨率熔解曲线技术为基础检测EKLF基因突变的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

（1）待测样本DNA准备：采集被检测者外周血标本，采用柱式法提取样本DNA；

（2）高分辨率熔解曲线反应体系：

10μLPCR反应体系包括:10×Taq buffer（含20mMMg2+）1.0μL，2.5nM dNTPs 0.4μL，5U/μlTaq DNA聚合酶0.2μL，10μM上下游引物0.6μL，1×LC Green 1μL，模板DNA0.8μL，5MBetain 2.0μL，DMSO 1.0μL，去离子水3.0μL；

（3）PCR反应程序：

按照特定的循环条件在PCR仪上进行，95℃预变性5分钟；95℃ 30秒，63-68℃ 30秒，72℃ 30秒，共45个循环；95℃ 1分钟，4℃保温；

（4）PCR扩增完成后在高分辨率熔解曲线分析仪（LightScanner HRⅠ96）上进行检测荧光，起始温度为55℃，终止温度为98℃和待机温度为42℃；横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。

9.一种以高分辨率熔解曲线技术为基础检测EKLF基因突变的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在检测样本中EKLF基因突变中的应用。