[发明专利]一种检测百合中车前草花叶病毒的实时荧光定量PCR方法

说明书

本发明提供一种检测百合中车前草花叶病毒的实时荧光定量PCR方法。包括取待测百合植株的叶片，提取总RNA；以提取的百合叶片总RNA为模板，进行逆转录反应获得cDNA；以获得的cDNA为模板，利用特异性引物对CP‑2F/R进行基于荧光染料SYBRGreenI的实时荧光定量PCR检测；以不同浓度的含检测基因片段的质粒PlAMV‑CP2标准品为模板制作标准曲线；根据检测结果Cq值判断植株的带病情况，根据标准曲线对带病植株的病毒进行定量计算。本发明对侵染车前草花叶病毒的百合植株的鉴定具有快速简便、灵敏度高及可重复性强的优点，其检测灵敏度是常规RT‑PCR的100倍，可用于进出境口岸和百合生产中车前草花叶病毒的快速诊断、定量检测及监测防控。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，特别是涉及一种检测百合中车前草花叶病毒的实时荧光定量PCR方法。

背景技术

在生产中，百合采用无性繁殖方式进行繁殖，易感染多种病毒，导致其种球减产、花蕾畸形和凋落，严重影响了百合的产量和品质，我国种植的百合中检测到PlAMV病毒逐渐成为一种危害百合生产的主要病害。百合感染PlAMV后，叶脉呈锈色，花蕾干枯死亡，发病后期坏死严重，导致大面积切花丧失商业价值。PlAMV属甲型线状病毒科(Alphaflexiviridae)，马铃薯X病毒属(Potexvirus)成员)。PlAMV是单链正义RNA病毒，长约6100个核苷酸，全基因组包含5个开放阅读框；ORF1编码一个依赖RNA的RNA聚合酶，ORF2-4编码三个重叠基因蛋白参与病毒的运动和ORF5编码外壳蛋白。PlAMV具有广泛的宿主范围，该病毒除侵染车前草、百合外，还可侵染油菜、报春花、南天竹等植物，危害极为严重。

目前，病毒的检测方法包括酶联免疫吸附试验、直接组织印迹、逆转录环介导的等温扩增、常规RT-PCR和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)等，其中，RT-qPCR作为一种高效、便捷、稳定性好及可定量的检测技术已广泛应用于蔬菜、花卉、果树等植物的病毒检测中。

迄今为止，针对PlAMV的检测开发了多种技术，用RT-LAMP方法对侵染本氏烟和百合的PlAMV进行检测或者使用ELISA和RT-PCR方法检测了入境哥斯达黎加百合的PlAMV，这些方法虽然可以检测出PlAMV，但是在检测灵敏度和定量等方面存在劣势。因此，亟需建立适用于百合PlAMV快速灵敏的RT-qPCR检测技术。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测百合中车前草花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，用于解决现有技术中对带有PlAMV植株的鉴定操作繁琐、灵敏度低和定量复杂等缺陷，本发明可为PlAMV的准确高效监测防控提供技术支持。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种快速鉴定百合中车前草花叶病毒侵染植株的方法，包括如下步骤：

(1)取待测百合植株的叶片，提取总RNA；

(2)以提取的百合叶片总RNA为模板，进行逆转录反应，获得cDNA；

(3)以步骤(2)的cDNA为模板，利用特异性引物对CP-2F/R进行基于荧光染料SYBRGreenI的实时荧光定量PCR检测；所述特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述特异性引物的序列如下：

CP-2F：5’-TCTTCGATGGCCTCCTCAAC-3’，

CP-2R：5’-TAGGGATCGTGCCGTCTCAT-3’，

(4)以不同浓度的含有检测基因片段的质粒PlAMV-CP2标准品为模板制作标准曲线；

(5)根据步骤(3)的检测结果判断植株的带病情况，根据步骤(4)获得的标准曲线对带病植株的病毒进行定量计算。

本发明主要适用于百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)植株的鉴定。