[发明专利]一种高效制备烟酰胺单核苷酸的方法及融合蛋白在审
| 申请号： | 202111076885.X | 申请日： | 2021-09-14 |
| 公开（公告）号： | CN115637262A | 公开（公告）日： | 2023-01-24 |
| 发明（设计）人： | 孙华君;熊淑婷;郭晨;赵威;江汝泳;谈敏;郑艳;唐佳乐;钱志强 | 申请（专利权）人： | 湖北远大生命科学与技术有限责任公司 |
| 主分类号： | C12N9/12 | 分类号： | C12N9/12;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/30;C12R1/19 |
| 代理公司： | 上海弼兴律师事务所 31283 | 代理人： | 王卫彬;黄益澍 |
| 地址： | 435229 湖北*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 高效 制备 烟酰胺单 核苷酸 方法 融合 蛋白 | ||
【说明书】：
本发明提供了一种融合蛋白及其在制备生产烟酰胺单核苷酸的催化剂中的应用，所述融合蛋白包括使用linker相连的烟酰胺核糖激酶NRK和ATP循环酶。本发明还提供了一种蛋白组合及其应用，所述蛋白组合包括上述融合蛋白中的烟酰胺核糖激酶NRK和ATP循环酶。本发明还提供了编码上述融合蛋白或蛋白组合的核酸、含有该核酸的重组表达载体以及含有该核酸或该重组表达载体的转化体以及它们的应用。本发明还提供了一种高效制备烟酰胺单核苷酸的方法，该方法使用了上述融合蛋白或蛋白组合，具有酶的活性高、底物浓度高以及反应效率高的进步效果。
技术领域
本发明属于生物合成领域，具体涉及一种高效制备烟酰胺单核苷酸的方法及可用于制备烟酰胺单核苷酸的融合蛋白或蛋白组合，还涉及编码融合蛋白的分离的核酸、含其的载体和转化体。
背景技术
β-烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，缩写成NMN)是生物体内存在的一种物质，它在被烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺苷化后即转化成生物细胞所赖以生存的重要物质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+，又称辅酶I)。2017年3月David Scinclair研究团队发表在《Science》上的一项研究表明，NAD+在小鼠体内的增加，使得大龄小鼠的组织和肌肉衰老迹象被逆转，这表明人类返老还童不再是梦想。由于NAD+分子量过大，无法通过口服摄取至细胞内，其体内主要依赖于细胞的合成，而且合成量很低。但随着对NAD+前体小分子物质NMN的研究发现，食用自NMN可以有效提升体内NAD+的含量升高，并显著抑制衰老引起的新陈代谢，使得自NMN成为了“不老神药”。截至目前，人们已经发现烟酰胺单核苷酸具有诸如延缓衰老、治疗帕金森等老年病、调节胰岛素分泌、影响mRNA的表达等诸多医疗保健用途。
目前合成NMN的主要方法包括：化学合成、生物催化法。其中化学法成本高，同时造成严重的环境污染，己逐渐被生物催化法取代。相比较而言，生物酶法催化生产NMN更加高效、成本更低、节能环保。目前，有三种生物催化方法生产NMN，第一种是以烟酰胺核糖(NR)为原料，通过烟酰胺核糖激酶(Ribosylnicotinamide kinase，EC 2.7.1.22，简写NRK酶)在ATP供应下生成NMN。第二种是以烟酰胺、核糖和ATP为底物，经D-核糖激酶(Ribokinase，EC2.7.1.15)、核酸磷酸焦磷酸激酶(ribose phosphate pyrophosphokinase，EC 2.7.6.1)、和烟酰胺核糖磷酸转移酶(Nicotinamide phosphoribosyltransferase，EC.2.4.2.12)催化反应生成NMN。第三种是以腺苷或AMP、ATP、烟酰胺为原料，经腺苷激酶(EC 2.7.1.20)(以AMP为原料时不需要此酶)、腺嘌呤磷酸核糖转移酶(EC 2.4.2.7)、烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase，EC.2.4.2.12)催化生成NMN。
上述第二种、第三种方法最后均以5-磷酸核糖基-1-焦磷酸(Phosphoribosylpyrophosphate，PRPP)和烟酰胺通过烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamidephosphoribosyltransferase，EC.2.4.2.12)制备NMN。因烟酰胺磷酸核糖转移酶催化为可逆反应，合成NMN的同时也能水解NMN，反应转化率较低。同时，中间体PRPP化合物的合成难以实现且PRPP不稳定，收率非常低，不利于反应进行，成为了反应的主要限制条件。
而上述第一种方法直接以烟酰胺核糖为原料，底物转化率高，收率高，产品纯度高，未来将成为NMN的主流生产方法。目前已经有专利公开了一种新的烟酰胺核糖激酶及其突变体作为工业酶在催化合成β-烟酰胺单核苷酸中的方法与应用(专利号：CN110373398A)。但在单一的NRK条件下，ATP使用量大，成本高，后提取难度大。
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- 朱振宇;孙大鹏 - 武汉爱博泰克生物科技有限公司
- 2022-06-29 - 2023-09-29 - C12N9/12
- 本发明公开了一种TaqDNA聚合酶突变体及其应用。所述TaqDNA聚合酶突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生如下突变：E9K、L15S、D18R、H20E、H21E、K31E和R37D等。本发明通过点诱变获得TaqDNA聚合酶突变体，与野生型TaqDNA聚合酶不同，具备高效、稳定的逆转录酶活性，能够以RNA底物为高效转化cDNA，并在标准反应条件下扩增该cDNA，无需额外添加逆转录酶，能够显著提高通过实时荧光定量PCR检测目标核糖核酸(RNA)的效率。
- 一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用-202310050404.0
- 朱振宇;孙大鹏 - 武汉爱博泰克生物科技有限公司
- 2022-06-29 - 2023-09-29 - C12N9/12
- 本发明公开了一种TaqDNA聚合酶突变体及其应用。所述TaqDNA聚合酶突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生如下突变：E9K、L15S、D18R、H20E、H21E、K31E和R37D等。本发明通过点诱变获得TaqDNA聚合酶突变体，与野生型TaqDNA聚合酶不同，具备高效、稳定的逆转录酶活性，能够以RNA底物为高效转化cDNA，并在标准反应条件下扩增该cDNA，无需额外添加逆转录酶，能够显著提高通过实时荧光定量PCR检测目标核糖核酸(RNA)的效率。
- 大豆GmLecRLK1基因在调控植物根瘤固氮效率和/或产量中的应用-202210516310.3
- 曹扬荣;黄魁;欧雅娟;李豪;朱辉 - 华中农业大学
- 2022-05-12 - 2023-09-29 - C12N9/12
- 本发明涉及基因编辑技术领域，特别是涉及大豆GmLecRLK1基因在调控植物根瘤固氮效率和/或产量中的应用。本发明通过在大豆根瘤中超表达大豆GmLecRLK1基因，确定了该基因可以降低植物根瘤数目和固氮酶活性；进而通过RNA干扰降低了GmLecRLK1基因在大豆中的表达水平，与对照相比，RNA干扰的植株根瘤固氮酶活性和根瘤数目显著提高，说明该基因及其表达的GmLecRLK1蛋白调控了根瘤的固氮效率，抑制该基因的表达，可以提高豆科植物的固氮效率，从而增加植物的生物量和产量，这在豆科作物固氮机制研究以及农业生产上具有应用前景。
- 一种MMLV突变体及其应用-202210916589.4
- 曹林;聂俊伟;叶廷跃 - 南京诺唯赞生物科技股份有限公司
- 2022-08-01 - 2023-09-26 - C12N9/12
- 本发明提供一种逆转录酶MMLV突变体，涉及生物技术领域，具体涉及一种MMLV突变体及其应用。本发明的MMLV突变体由于缺失以DNA为模板的DNA聚合酶活性，可以避免在逆转录的过程中提前合成第二链cDNA，进而解决现有技术中链特异性不足的问题。
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