[发明专利]寡糖的制备

说明书

本发明涉及一种用于制备重组寡糖、优选3～8个单糖单元的重组寡糖、更优选3～5个单糖单元的重组寡糖、特别是HMO的转基因微生物，其包含一种或多种编码蔗糖利用系统的基因，因此微生物可以使用蔗糖作为碳源和能量来源。一种或多种编码蔗糖利用系统的基因优选为一种或多种编码异源PTS依赖性蔗糖利用转运系统的基因，如scr基因。

本申请是2015年6月29日提交的发明名称为“寡糖的制备”、申请号为“201580034968.9”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是用转基因微生物特别是大肠杆菌(E.coli)，用蔗糖作为其专用碳源的重组寡糖、特别是人乳寡糖(HMO)的微生物制备。

背景技术

近来，使用重组微生物的异种(foreign)或外源寡糖的发酵合成在商业和工业上已经变得备受关注。在这种合成中，目的寡糖将通过由微生物的一种或多种异源糖基转移酶介导的糖受体的酶促糖基化来合成，并且糖基化所需的一种或多种活化的糖核苷酸将由相同的微生物通过过表达一种或多种编码内源活化的糖核苷酸产生酶的基因来制备。这种合成的代谢路径需要碳源，其主要为简单的碳结构单元，通常为甘油或葡萄糖(参见，例如，WO01/04341，Priem等人的Glycobiology12,235(2002)，Fort等人的Chem.Comm.2558(2005)，Drouillard等人的Angew.Chem.Int.Ed.45,1778(2006)，WO2010/070104，WO2012/112777，WO2013/182206，WO2014/048439)。在一些合成中，如果乳糖也用作受体，则其可以是碳源(Lee等人的Microb.Cell Fact.11：48(2012))。由于微生物已经经过基因操作，抗生素抗性选择标记基因已经采用，以将转化的微生物与接种物和发酵液中未转化的微生物分开。然而，通过将编码参与供体糖的重新(de novo)生物合成的酶的基因整合进微生物的染色体中，已经避免了抗生素的使用(等人的Microb.Cell Fact.12：40(2013))。

大约50％的野生型大肠杆菌能够采用蔗糖作为碳源和能量来源，但是它们中的大多数是致病的。在工业中合成化学物质主要使用的大肠杆菌菌株无法在蔗糖上存活和生长(Bruschi等人，Biotechnol.Adv.30，1001(2012))。然而，在某些情况下，蔗糖可以是更廉价的碳源和能量来源。出于这个原因，已经在尝试开发能够在蔗糖上存活并生长的大肠杆菌的suc⁺菌株(例如，Sabri等人的Appl.Environ.Microbiol 79，478(2013))并且通过它们来制备工业上可获利的产品，比如氨基酸、生物燃料、类胡萝卜素等(例如，EP-A-1149911，EP-A-2239336，EP-A-2371952，EP-A-2405006，WO2010/051849，WO2012/078311，Kim等人的Biores.Technol.130，288(2013))进行了尝试。然而，这些suc⁺转化株通常没有suc^—菌株多产(Khamduang等人的J.Ind.Microbiol.Biotechnol.36，1267(2009))。

WO2012/007481描述了表达蔗糖磷酸化酶或蔗糖转化酶与果糖激酶联合的大肠杆菌转化株。从而，微生物能够采用蔗糖作为其主要碳源产生2’-岩藻糖基乳糖。而且，WO2014/067696描述了包含能够使其在蔗糖上生长并产生岩藻糖的csc基因簇的大肠杆菌转化株。

然而，一直需要使用能够采用更有效的蔗糖作为碳源和能量来源的转化微生物，用于制造重组寡糖、特别是HMO的替代方法。

发明内容

本发明的第一方面涉及通过使碳水化合物受体糖基化来制备重组寡糖、优选3～8个单糖单元的重组寡糖、更优选3～5个单糖单元的重组寡糖、特别是HMO的方法，所述碳水化合物受体优选为乳糖，并且不是蔗糖，所述方法包括以下步骤：

a)提供一种细胞，优选为大肠杆菌细胞，其能够使所述受体内化至所述细胞，并且其包含