[发明专利]一种构建丙酸生产菌的方法

说明书

本发明公开了一种构建丙酸生产菌的方法，包括以下步骤：中断谷氨酸棒杆菌基因组中ldh基因，整合入大肠杆菌来源的scpA、scpB和scpC的表达基因，筛选出厌氧条件下生产丙酸、但不生产乳酸的工程菌。该工程菌发酵产生的丙酸能够用于制备食品级的丙酸钙。

技术领域

本发明属于代谢工程领域，具体地说，涉及一种产丙酸的谷氨酸棒杆菌工程菌的构建方法、以及食品级丙酸钙的制备方法。

背景技术

丙酸钙广泛应用于食品、酿造、饲料、中药等行业，如面包、食醋、酱油、酱油食品蛋糕等。像其他脂肪酸一样，丙酸钙可以通过新陈代谢被人和动物吸收，并为人和动物提供必要的钙。丙酸钙被世卫组织和粮农组织批准用于安全食品和饲料使用酸基防腐剂，在酸性条件下，产生游离酸，具有抗菌作用，其防腐性能优越，是一种理想的食品防腐剂。GlobalIndustry Analysts,Inc.于2021年发布的调研报告指出，丙酸钙2020年估算为2亿8,130万美元的全球市场，在2020年～2027年期间预计将以4％的年复合成长率增长，2027年之前达到3.7亿美元。

丙酸钙主要制备方法是由丙酸和氢氧化钙直接反应制备丙酸钙，此方法耗能高，污染大，由于化工产品丙酸不是生物基来源，一定程度上影响其在高端产品中的应用。此外还有发酵法制备丙酸，然后发酵液浓缩后加入氢氧化钙进行反应制备丙酸钙，目前丙酸发酵菌株主要有产酸丙酸杆菌、费氏丙酸杆菌等，产物浓度最高可达90g/L，但是发酵周期要300小时(Gonzalez-Garcia R.,et al.,Microbial Propionic Acid Production[J].Fermentation,2017,3(2):21.)。Jing L.等(Jing L.,et al.,Construction of a novelanaerobic pathway in Escherichia coli for propionate production[J].BmcBiotechnology,2017,17:1.)报道了一种产丙酸大肠杆菌，厌氧发酵72h可产丙酸4.95g/L。虽然大肠杆菌增殖速度很快，考虑到丙酸钙越来越多地用于食品、药品制造，而大肠杆菌因含有内毒素，且普通消费者一般将大肠肝菌视为致病性细菌而产生心理排斥等问题，导致通过大肠杆菌发酵获得的丙酸难以向医药、食品和化妆品等行业推广使用。

发明内容

为了克服上述产酸丙酸杆菌和费氏丙酸杆菌增值速度慢且发酵周期过长、大肠肝菌造成发酵产品销售障碍和接受度低的缺陷，提高丙酸/丙酸钙被食品和药品销售商和消费者的接受度，发明人尝试了通过公认安全微生物(GRAS)比如谷氨酸棒杆菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌等作为菌种通过发酵来生产丙酸的可行性，终于在谷氨酸棒杆菌中取得了成功。具体而言，本发明包括如下技术方案。

一种构建丙酸生产菌的方法，其包括以下步骤：

A.中断谷氨酸棒杆菌基因组中乳酸脱氢酶(ldh，NCBI登录号NP_602100.1)基因，得到菌株A；

B.构建用于在谷氨酸棒杆菌菌株中表达的大肠杆菌来源的甲基丙二酰辅酶A变位酶(scpA，NCBI登录号：NP_417392.1)基因表达元件、大肠杆菌来源的甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(scpB，NCBI登录号：NP_311816.2)基因表达元件、大肠杆菌来源的丙酰辅酶A：琥珀酰辅酶A转移酶(scpC，NCBI登录号：NP_417396.4)基因表达元件，并将这三个基因表达元件分别或者共同克隆入用于在谷氨酸棒杆菌菌株中表达的质粒载体中，得到基因表达质粒；

C.将步骤B中得到的基因表达质粒转入步骤A中得到的菌株A中，筛选基因组中整合了所述scpA、scpB和scpC编码基因的阳性克隆即菌株C；

D.从菌株C中筛选出厌氧条件下生产丙酸的工程菌。

优选地，上述每个基因表达元件包括启动子Psod、编码基因序列、终止子rrnBT1T2。