[发明专利]一种抗烟草花叶病毒的核酸农药及其合成、纯化和应用

说明书

本发明提供了一种抗烟草花叶病毒的核酸农药及其合成、纯化和应用，TMV‑cp基因两端分别含有一个T7启动子，序列如SEQ ID NO.1所示，质粒pT7B‑TMV‑EcoRI‑EcoRI‑cp采用TMV‑cp基因，在T7启动子的两侧引入EcoRI酶切位点得到；加入内切酶EcoRI，消化获得体外转录的模板，加入含肌苷酸的三磷酸核苷混合物体外转录并纯化，得到TMV‑cp(I)‑dsRNA；本发明首次使用生物法合成经肌苷酸修饰的dsRNA，该核酸农药在不同温度和不同紫外条件下具有稳定性，具有防治烟草花叶病毒的巨大潜力；该核酸农药对环境无毒无害，成本控制及应用方面均获得良好效果，有望成为优秀的生物农药。

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种抗烟草花叶病毒的核酸农药及其合成、纯化和应用。

背景技术

烟草是我国重要的经济作物之一，具有悠久的种植历史。烟草病毒病是我国烟草上发生最普遍、最广泛、危害最严重的病害之一，是由烟草花叶病毒(Tobacco mosaicvirus,TMV)感染引起。TMV是一种单链RNA病毒，非常稳定且寄主广泛，极易感染烟草等茄科作物。近年来，烟草花叶病毒病在我国的发生呈逐年上升趋势，感染病毒后会造成烟草减产、品质降低，甚至绝收，严重威胁了我国烟草的安全生产和发展。因此烟草病毒病的防治、控制和对易感染植株进行治疗显得尤为重要。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来重要的生物学发现之一，发现RNAi机制的两位美国科学家因此获得了2006年的诺贝尔生理学或医学奖。RNAi是在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的基因沉默现象，该技术已广泛应用在农业领域及恶性肿瘤、传染性疾病等医学基因治疗等领域中。RNAi在农业领域中的应用，主要通过寄主诱导的基因沉默、病毒诱导的基因沉默和喷雾诱导的基因沉默3种方式实现。其中，喷雾诱导的基因沉默方式类似于传统农药的施用方法，通过直接向作用对象喷施或注射dsRNA，经害虫取食或病原体侵染达到沉默靶基因的效果，便于在农业活动中应用推广。

dsRNA农药应用于植物病虫害防治中的优势：1)由于dsRNA具有高度特异性、靶向性，故对非靶标生物安全；2)RNA属于天然存在于环境或生物体内的物质，可通过天然途径降解，无残留风险；3)相比现有的化学农药，dsRNA更难产生抗药性；4)生产方式为清洁化生产，不会对环境产生影响；5)生产路线为平台化技术，可以针对所有种类的有害生物开发此类产品。因此，相较于传统的化学农药防治，基于RNA干扰技术制备的核酸农药在防治病虫害上具有潜在的、良好的应用前景，RNA生物农药被认为是农药领域的第三次革命。

核酸在靶标生物内部及环境中受到核酸酶、光照、pH等多种复杂因素的影响，使得其稳定性较差，从而容易导致靶基因沉默效率大打折扣。为了提高核酸的稳定性，目前大都采用化学修饰以增强包含21-22碱基对的小核酸siRNA药物的有效递送，常用的化学修饰主要包括磷酸基团修饰、碱基修饰和核糖修饰等，如核糖修饰中使用频率较高的有2’-甲氧基(2’-OMe)、2’-甲氧基乙氧基(2’-MOE)和2'-F。近年有研究显示可在siRNA正义链(sensestrand,ss)修饰中使用肌苷酸(又名次黄嘌呤核苷酸inosinc acid,简写I)替代鸟苷酸，结果表明这些修饰可以提高RNAi活性(HaripriyaAddepalli,2010)。相对于21个碱基对的siRNA的化学合成和修饰，上百个碱基对的长链dsRNA合成成本高，化学合成难以实现，更不利于规模化生产，且目前关于dsRNA的稳定性修饰研究较少。

参考文献：