[发明专利]一种可高效用于黏细菌原核转录组建库测序的方法

说明书

本发明公开了一种可高效用于黏细菌原核转录组建库测序的方法。它包括样品准备、RNA提取、mRNA富集及片段化，将mRNA反转录第一链cDNA，再合成第二链cDNA、构建文库、上机测序和对数据进行分析，其特征在于，所述的将mRNA反转录第一链cDNA，其使用的逆转录酶是Uni Reverse Transcriptase逆转录酶。本发明通过实验的手段证明了利用耐高温的逆转录酶可以显著提升转录的效率，有效提升高GC含量细菌的原核转录组测序成功率。

技术领域：

本发明属于分子生物学及高通量测序领域，具体涉及一种能够用于黏细菌原核转录组建库测序的方法。

背景技术：

黏细菌是一类在土壤中广泛分布的、具有捕食特性的细菌类群，大多数黏细菌能够通过狼群式的(wolf-pack)群体运动行为对土壤中的真菌、细菌、小型藻类和原生动物等进行捕食。此外，黏细菌作为位于土壤微生物食物链顶端的捕食者，能够通过捕食作用调控土壤微生态平衡，被认为是一类具有多重生防特性的新型微生物类群。

通常认为，在有猎物存在的情况下，黏细菌的细胞以协同的方式运动，形成swarms，当swarms与猎物接触时，黏细菌可以侵入菌群内部并通过分泌胞外裂解因子，例如抗菌物质、次级代谢产物、胞外酶等，作为攻击的武器杀死和裂解猎物细胞，并能利用猎物细胞裂解后释放的蛋白作为营养供自身生长。由于黏细菌捕食行为的高度复杂性，目前对黏细菌捕食相关的研究主要是集中在行为特征的描述方面，已确定的黏细菌捕食因子只有前述的黏菌霉素A和外膜型水解酶GluM，不同的捕食体系中介导猎物细胞裂解的黏细菌捕食因子尚未被完全鉴定，而鉴定特定捕食体系中黏细菌的捕食因子，分析其作用方式，才是解析黏细菌捕食机制的关键。

通过组学分析可能鉴定出一些参与捕食的胞外裂解因子。采用转录组学分析手段在组学水平探讨“捕食者响应猎物”而启动的或提高表达的基因谱和分泌的捕食酶谱，可以全面快速的获取特定微生物在特定状态下的所有转录本信息，对mRNA的表达量和差异表达基因及其相应功能进行分析，揭示微生物不同表型形成的分子调控机制和功能。

到目前为止，利用原核转录组测序手段研究黏细菌发育过程及捕食机制的研究仅有5篇报道，其中黏细菌捕食细菌之后的转录组学研究仅1篇报道。而国内外还没有建立起一种有效的黏细菌捕食猎物细菌之后的混合样品的原核转录组建库测序方法。

发明内容：

为了克服现有的各大生物公司广泛采用的标准化原核转录组测序技术的缺陷，本发明所解决的技术问题在于提供一种可以高效实现黏细菌这类高GC含量的细菌原核转录组构建特定的链特异性cDNA文库的方法，利用本发明的方法可以构建高质量的测序文库，保证测序下机数据与参考基因组的高mapping率(90％以上)，所使用的耐高温的逆转录酶相比进口试剂成本低、效果优良，为今后开展黏细菌这类高GC含量的原核生物转录组测序提供了新的技术方法。

本发明通过实验发现利用目前国内各大生物公司的原核转录组测序标准流程对黏细菌进行转录组测序时普遍存在测序下机数据与参考基因组mapping率低的问题。对整个实验过程包括样品准备、RNA提取、去核糖体RNA富集mRNA和ncRNA、链特异性文库构建及上机测序等进行分析，发现样品准备和RNA提取过程不存在污染，测序过程中也没有污染。因此推测可能现有的建库不适合黏细菌这类高GC含量的细菌。

M-MuLV逆转录酶是从E.coli菌株提取出来，此菌株含有一个克隆有M-MuLV RT基因的质粒，M-MuLV基因被删去了RNAase H核心部分。M-MuLV Rtase是一个依赖RNA的DNA聚合酶，在引物存在的条件下，可以以单链的RNA或DNA为模板合成互补DNA链，它缺少RNAse H活性。MMuLV的主要特点是RNase H活性超低，cDNA得率高，是目前国内各大生物公司原核转录组建库过程中广泛使用的一款逆转录酶。