[发明专利]一种新型宫颈癌甲基化基因检测方法

说明书

本发明涉及宫颈癌检测技术领域，且公开了一种新型宫颈癌甲基化基因检测方法，包括：采用PCR扩增液对经亚硫酸氢盐转化后的bis‑DNA进行探针荧光定量PCR扩增，具体为：针对bis‑DNA正链和负链分别设计正反向引物、检测探针、以及特异性的封闭探针，使用检测探针特异性结合甲基化序列目的靶标基因PAX1、FAM19A4、hsa‑mir124‑2、ATP10A、HAS1、以及内参ACTB(β‑actin)基因，使用特异性的封闭探针结合非甲基化的序列；根据PAX1、FAM19A4、hsa‑mir124‑2、ATP10A、HAS1与ACTB基因PCR扩增结果的相对荧光CT值来确定待检测样本的甲基化值，分别计算PAX1、FAM19A4、hsa‑mir124‑2、ATP10A、HAS1相对于ACTB基因的甲基化值。本发明取得了提高宫颈癌甲基化基因检测灵敏度和特异性的技术效果，并且发现了独特新甲基化靶标：HAS1、ATP10A。

技术领域

本发明涉及宫颈癌检测技术领域，具体为一种新型宫颈癌甲基化基因检 测方法。

背景技术

通过分析现有的宫颈癌筛查技术资料可知，现有技术存在较多缺陷，具 体如下：

一、HPV筛查：灵敏度高，但特异性低，多数HPV感染可以被机体自 动清除。

二、液基细胞学检测方法(TCT)：明显提高癌变细胞的检测率，并相应 减少需要重复做巴氏测试的次数，从而降低了患者因被重做测试而引起不必 要的担心。但取材、制片、阅片水平的参差不齐。样本中含有很多正常宫颈 细胞，可能检测不到相对较少的异常细胞容易造成假阴性，漏检率高。误差 仍旧不可避免，测试结果仍然不准确。

三、阴道镜检查：可及时发现宫颈病变，但可能会造成医源性生殖道的 物理损伤，绝经后女性雌激素水平低，生殖道上皮更薄，病变更隐匿不易识 别。

四、传统的甲基化检测方法：甲基化特异性PCR及亚硫酸氢盐测序法。 然而这些方法存在操作繁琐、准确性低及敏感性不高的缺点，限制了其在临 床实验室的广泛应用；同时影响较大的结果多来自欧美实验室、研究对象多 为国外白人女性，研究靶标不一定适合中国女性；通过分析大量技术资料得 知，大多数甲基化Real-time PCR研究方法只检测DNA的一条链，检测灵 敏度较低。使用单重PCR检测技术，在一个反应体系中只检测一个靶标，检 测效率低，检测成本高。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，为了实现下述技术目的：

一、筛选出真正适合中国女性的独特新甲基化靶标与靶标组合；

二、检测效率高，2小时左右可出结果，结果客观，降低对医师经验的依 赖，普及方便；

三、提高检测灵敏度和特异性；本发明针对重亚硫酸盐转化后的DNA正 链和负链分别设计引物和特异性探针，同时结合封闭探针的使用，防止探针 结合到非甲基化链上；

四、降低检测成本，提高检测效率；使用多重PCR检测技术，在一个反 应体系中同时检测多个靶标基因；

本发明提供一种新型宫颈癌甲基化基因检测方法。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种新型宫颈癌甲基化基因检测方法，包括以下步骤：

步骤一，提取宫颈脱落细胞的基因组DNA；

步骤二，对提取的基因组DNA进行重亚硫酸盐转化，得到bis-DNA；

步骤三，采用PCR扩增液对bis-DNA进行探针荧光定量PCR扩增，具 体为：