[发明专利]一种R-氰醇裂解酶的制备方法及其应用

说明书

本发明提供了一种新型的、来源于芒果的R‑氰醇裂解酶的制备方法及其应用。具体地，通过通过构建随机突变和点饱和突变文库，以及高通量筛选获得多种突变的氰醇裂解酶，其方法安全、简单且易于操作。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种R-氰醇裂解酶的制备方法及其应用。

背景技术

手性氰醇(酯)是一类在工业不对称合成生产中具有重要地位的手性原料，同时，它能很容易地转化为手性α-羟基酸(酯)、α-氨基酸、β-氨基醇等具有重要商业价值的医药和农药中间体，因此，手性氰醇的合成一直是学术界和工业界的关注热点之一。手性氰醇的合成有一定的难度和挑战性，其不对称合成需要使用手性化学或者生物催化剂，其中生物催化剂(氰醇酶)由于来源丰富、成本低廉、催化效率高、反应条件温和、产率和光学纯度高、底物适用范围广等特点，而远远优于化学催化剂，被广泛使用在有机合成工业中。

氰醇(裂解)酶催化HCN与醛酮的加成，生成α-手性氰醇产物。天然的R-氰醇酶存在于蔷薇科李属植物及一些水果中，目前只有来源于蔷薇科植物的才是工业化应用成功的案例，比如Prunus amygdalus(Pa HNL)、Prunus domestica(Pd HNL)或者Prunus mume(PmHNL)等，其中又以Prunus amygdalus(Pa HNL)的氰醇裂解酶为主，所以寻找其它来源的氰醇酶，并且将其应用到手性氰醇的工业化生产中，具有很重要的实际意义。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有R-氰醇裂解酶制备方法中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明其中一个目的是，提供一种R-氰醇裂解酶的制备方法及其应用。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种R-氰醇裂解酶的制备方法，包括，

R-氰醇裂解酶野生型基因进行突变处理：将R-氰醇裂解酶基因，氰醇裂解酶的野生型基因序列如Seq ID No.1所示进行突变处理，处理后得到氰醇裂解酶突变子基因，氰醇裂解酶突变子基因序列如Seq ID No.2所示；

添加酶切位点：向氰醇裂解酶突变子基因中插入双酶切位点；

制备重组质粒：将氰醇裂解酶突变子基因插入到表达载体中得到重组质粒；

导入菌株：将带有氰醇裂解酶基因的重组质粒导入到菌株中得到重组表达菌株；

菌株的分泌和表达：将重组表达菌株在培养液中诱导表达然后收集酶液。

作为本发明所述R-氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述突变处理的方式为易错PCR。

作为本发明所述R-氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述添加酶切位点中，双酶切位点为NdeI/HindIII。

作为本发明所述R-氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述制备重组质粒中，表达载体为pET26b(+)，其N端包含信号肽pelB leader。

作为本发明所述R-氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述导入菌株中，所述菌株为E.coli BL21(DE3)。

作为本发明所述R-氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述菌株的分泌和表达中，所述培养液为LB培养基。