[发明专利]一种R-氰醇裂解酶的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种R-氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：包括，

R-氰醇裂解酶野生型基因进行突变处理：将R-氰醇裂解酶基因，氰醇裂解酶的野生型基因序列如Seq ID No.1所示进行突变处理，处理后得到氰醇裂解酶突变子基因，氰醇裂解酶突变子基因序列如Seq ID No.2所示；

添加酶切位点：向氰醇裂解酶突变子基因中插入双酶切位点；

制备重组质粒：将氰醇裂解酶突变子基因插入到表达载体中得到重组质粒；

导入菌株：将带有氰醇裂解酶基因的重组质粒导入到菌株中得到重组表达菌株；

菌株的分泌和表达：添加信号肽，将重组表达菌株在培养液中诱导表达然后收集酶液。

2.如权利要求1所述R-氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：所述突变处理的方式为易错PCR。

3.如权利要求1所述R-氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：所述添加酶切位点中，双酶切位点为NdeI/HindIII。

4.如权利要求1所述R-氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：所述制备重组质粒中，表达载体为pET26b(+)，其N端为信号肽pelB leader，信号肽的基因序列如Seq ID No.5所示。

5.如权利要求1所述R-氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：所述导入菌株中，所述菌株为E.coli BL21(DE3)。

6.根据权利要求1所述R-氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：所述菌株的分泌和表达中，所述培养液为LB培养基。

7.如权利要求1所述R-氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：所述菌株的分泌和表达中，还包括诱导培养，当培养基中OD₆₀₀＝1.0后，加入0.2mM IPTG并且保持温度为30℃，诱导表达4～5h。

8.如权利要求1～7所述R-氰醇裂解酶的制备方法制得的产品的应用，其特征在于：所述应用，包括，

将底物溶解于叔丁基甲醚(MTBE)中，得到底物的MTBE溶液；将所得到的产品稀释在磷酸盐-柠檬酸缓冲液中，并调节pH到3.4，得到酶液；将上述底物的MTBE溶液和酶液充分混合，使体系降温到10℃，搅拌成乳浊液后，加入液体氢氰酸反应得到R-苯乙氰醇和R-邻甲基苯乙氰醇。

9.如权利要求8所述R-氰醇裂解酶的应用方法，其特征在于：所述底物为苯乙氰醇和/或邻甲基苯乙氰醇中的一种或两种；所述底物的MTBE溶液浓度为8微升每毫升缓冲液；所述底物的MTBE溶液与酶液的体积比为2：1.2～1.7；所述液体氢氰酸的添加量与底物的MTBE溶液与酶液的总体积比为4～3.5：1.2。

10.如权利要求8所述R-氰醇裂解酶的应用方法所制得的R-苯乙氰醇和R-邻甲基苯乙氰醇，其特征在于：所述R-苯乙氰醇和R-邻甲基苯乙氰醇，其中，收率均≥99.5％，手性值(e.e值)均≥99.5％。