[发明专利]一种BCR-ABL基因融合检测的校准品和参考品的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种BCR-ABL基因融合检测的校准品和参考品的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

分别制备ABL野生型装甲RNA和BCR-ABL融合型装甲RNA；

使用保护稀释液分别对所述ABL野生型装甲RNA和BCR-ABL融合型装甲RNA进行溶解；

通过数字PCR对所述ABL野生型装甲RNA和BCR-ABL融合型装甲RNA的浓度进行检测；

使用保护稀释液对所述ABL野生型装甲RNA和BCR-ABL融合型装甲RNA进行梯度稀释，得到校准品；将ABL野生型装甲RNA校准品和BCR-ABL融合型装甲RNA校准品按比例混合，得到参考品。

2.根据权利要求1所述的BCR-ABL基因融合检测的校准品和参考品的制备方法，其特征在于，编码所述ABL野生型装甲RNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

优选地，编码所述BCR-ABL融合型装甲RNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

优选地，所述溶解前还包括将所述ABL野生型装甲RNA和BCR-ABL融合型装甲RNA在85～95℃下水浴裂解4～8min的步骤；

优选地，所述保护稀释液包括Tris-EDTA缓冲液、保护核酸和保护剂；

优选地，所述Tris-EDTA缓冲液的pH为7.0～8.5；

优选地，所述保护核酸包括载体RNA和/或鲑鱼精DNA；

优选地，所述保护核酸的终浓度为10～60ng/μL；

优选地，所述保护剂包括Triton X-100和/或Tween20；

优选地，所述Triton X-100的终浓度为0.005％～0.05％；

优选地，所述Tween20的终浓度为0.05％～0.5％。

3.根据权利要求1或2所述的BCR-ABL基因融合检测的校准品和参考品的制备方法，其特征在于，所述数字PCR的反应体系包括引物对、荧光探针和预混液；

优选地，所述引物对在所述反应体系中的终浓度为600～1200nM，所述荧光探针在所述反应体系中的终浓度为80～400nM；

优选地，扩增所述ABL野生型装甲RNA的引物对的序列如SEQ ID No.3～4所示，检测所述ABL野生型装甲RNA的荧光探针的序列如SEQ ID No.5所示；

优选地，扩增所述BCR-ABL融合型装甲RNA的引物对的序列如SEQ ID No.6～7所示，检测所述BCR-ABL融合型装甲RNA的荧光探针的序列如SEQ ID No.8所示；

优选地，所述荧光探针的5’端标记有荧光发生基团，3’端标记有荧光淬灭基团；

优选地，所述荧光发生基团包括FAM、HEX、VIC、TAMRA、ROX、Cy3或Cy5中的任意一种；

优选地，所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ2或BHQ3中的任意一种；

优选地，所述预混液包括缓冲液、反转录酶、DNA聚合酶和dNTPs；

优选地，所述数字PCR的反应程序包括：

反转录：40～60℃，13～16min；

预变性：94～98℃，8～12min；

循环扩增：94～98℃，10～30s；50～60℃，20～60s；循环40～50次。

4.根据权利要求1～3任一项所述的BCR-ABL基因融合检测的校准品和参考品的制备方法，其特征在于，所述梯度稀释后，ABL野生型装甲RNA校准品和BCR-ABL融合型装甲RNA校准品的终浓度依次为(1～5)×10⁵拷贝/μL、(1～5)×10⁴拷贝/μL、(1～5)×10³拷贝/μL、(1～5)×10²拷贝/μL、(1～5)×10¹拷贝/μL和1～5拷贝/μL；

优选地，所述参考品中，ABL野生型装甲RNA校准品和BCR-ABL融合型装甲RNA校准品的浓度比例依次为10:1、100:1、1000:1和10000:1。