[发明专利]一种变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种变形假单胞菌2‑酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。本发明以变形假单胞菌JSU01为基础菌株，敲除2‑酮基葡萄糖酸差向异构酶的全部编码序列或部分编码序列得到突变株JSU01ΔkguE。通过敲除2‑酮基葡萄糖酸差向异构酶，使获得的突变株对2KGA的分解代谢速率显著降低，而在2KGA发酵过程中的生长特性没有明显改变，表明2‑酮基葡萄糖酸差向异构酶是2KGA分解代谢过程中具有重要作用的酶，且所述酶存在与2KGA分解代谢呈正相关。所述的突变株JSU01ΔkguE具有更为优良的2KGA发酵生产性能。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株及其构建方法和应用。

背景技术

2-酮基葡萄糖酸(2-ketogluconic acid,2KGA)又称2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid)，目前主要用作生产食品添加剂D-异抗坏血酸及其盐类的前体，也可作为杂环化合物合成、区域选择性和立体选择性化学反应中的基础材料。

发酵法是目前最为经济、高效、环境友好的2KGA工业生产方法。2KGA发酵通常利用假单胞菌(Pseudomonas)、葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter)、欧文氏菌(Erwinia)、醋酸杆菌(Acetobacter)或沙雷氏菌(Serratia)，其中在国际上得到普遍使用的为假单胞菌。变形假单胞菌(P.plecoglossicida)JSU01是一株能够在高浓度葡萄糖存在的条件下迅速生长、高效合成2KGA菌株，是迄今为止国际上报道的2KGA合成效率最高的菌株之一，已成为我国2KGA发酵生产的主要工业用菌。目前，变形假单胞菌JSU01已于2013年1月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心中，保藏编号为CGMCC No.7150。

假单胞菌利用葡萄糖作为碳源时，2KGA的合成与分解代谢过程是同时存在的，即在2KGA发酵过程中，2KGA既是发酵目的产物，也是可被其生产菌株利用的中间代谢产物。这种现象的存在，客观上不利于提高2KGA发酵生产的经济性，同时也给其发酵生产过程控制带来了一些不确定的因素。因此，如何有效降低发酵液中的2KGA被转运至胞内进而被代谢利用成为进一步提升2KGA发酵水平的技术难题。

在假单胞菌中，与2KGA分解代谢相关的基因位于染色体上的2KGA利用操纵子(kgu操纵子)中。kgu操纵子的结构基因包括kguT、kguK、kguE和kguD，分别编码2-酮基葡萄糖酸转运蛋白(KguT)、2-酮基葡萄糖酸激酶(KguK)、2-酮基葡萄糖酸差向异构酶(KguE)和2-酮基-6-磷酸葡萄糖酸还原酶(KguD)。其中：KguT是一种跨膜转运蛋白，能够将周质空间或培养环境中的2KGA转运至细胞质中；KguK是一种ATP依赖性激酶，在ATP存在的条件下能够将2KGA磷酸化为2-酮基-6-磷酸葡萄糖酸；KguD是一种NADPH依赖性还原酶，能够将2-酮基-6-磷酸葡萄糖酸还原为中心代谢产物6-磷酸葡萄糖酸。KguE是一种与假单胞菌2KGA分解代谢相关的异构酶，但到目前为止，KguE在2KGA代谢中的作用尚未得到明确的阐释。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株(JSU01ΔkguE)，减少假单胞菌2KGA发酵过程中2KGA的分解代谢，具有更为优良的2KGA发酵生产性能。

本发明的目的还在于提供变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株在2KGA发酵生产中的应用，有利于减少假单胞菌2KGA发酵过程中2KGA的分解代谢，从而提高2KGA的产量。

本发明提供了一种变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株JSU01ΔkguE，以变形假单胞菌JSU01为基础菌株，敲除2-酮基葡萄糖酸差向异构酶的全部编码序列或部分编码序列。

优选的，敲除的2-酮基葡萄糖酸差向异构酶的全部编码序列如SEQ ID NO:1所示。