[发明专利]碱性蛋白酶基因、杂合启动子、重组表达载体、重组表达工程菌、碱性蛋白酶及方法和应用

说明书

本发明公开了一种碱性蛋白酶基因、杂合启动子、重组表达载体、重组表达工程菌、碱性蛋白酶及方法和应用，碱性蛋白酶基因bcp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的碱性蛋白酶基因bcp，其全长为1143bp，在枯草芽孢杆菌表达菌株中进行高效表达，从而降低碱性蛋白酶BCP的生产成本。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别地，涉及一种碱性蛋白酶基因。此外，本发明还涉及杂合启动子、重组表达载体、重组表达工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

蛋白酶能够分解蛋白质形成多肽以及游离氨基酸，在许多领域具有广泛的应用前景。蛋白酶来源广泛，目前产业化应用的蛋白酶主要来源于微生物，微生物来源蛋白酶具有种类多、酶学特性多样等特点。微生物来源的蛋白酶，根据作用pH可以分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及碱性蛋白酶。这三种蛋白酶根据各自不同的酶学性质分别应用于不同的工业领域。其中碱性蛋白酶作为一种丝氨酸蛋白酶，具有良好的活性和稳定性，能够有效分解各种蛋白质，目前主要应用于食品加工、洗涤以及饲料等领域。碱性蛋白酶作为一种常用的工业酶制剂，市场上主流的碱性蛋白酶产品则是来源于嗜碱芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及枯草芽孢杆菌。碱性蛋白酶的生产方式则主要分为天然菌发酵培养和异源高效表达两大类。天然菌发酵培养的优点是发酵周期短，缺点则是酶活低、发酵过程不稳定及培养基组成复杂、菌种容易退化等。相对于天然菌，异源重组表达具备发酵酶活高、发酵过程稳定可控等优点，因此其成为主流的生产方式。目前碱性蛋白酶异源表达宿主包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，其中枯草芽孢杆菌表达宿主的研究最多。枯草芽孢杆菌作为一种食品级表达宿主具有遗传操作简单、基因背景清晰、胞外分泌蛋白等优点。

发明内容

本发明提供了一种碱性蛋白酶基因、杂合启动子、重组表达载体、重组表达工程菌、碱性蛋白酶及方法和应用，以解决来源于芽孢杆菌的碱性蛋白酶的生产成本高、碱性蛋白酶发酵活力低的技术问题。

本发明采用的技术方案如下：

一种碱性蛋白酶基因bcp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

通过同源克隆获得环状芽孢杆菌碱性蛋白酶基因bcp。参照细菌基因组提取试剂盒提取环状芽孢杆菌基因组sy1(环状芽孢杆菌sy1由实验室前期从豆渣里面筛选获得)，根据NCBI数据库Bacillus circulans strain NCTC2610基因组序列(GenBank:UAPZ01000012.1：120935-122077)设计一对引物，即正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示(bc1-fw，5'–TCACGGCCG ATGAAGAAACTGTTGACGAAA-3'，下划线为Ec52I酶切位点)，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示(bc1-rev：5'-ACGTCTAGAGCGTGTTGCCGCTTCTGC-3'，下划线为XbaI酶切位点)。以提取的基因组为模板，通过PCR扩增获得碱性蛋白酶基因bcp。

上述碱性蛋白酶基因bcp为环状芽孢杆菌碱性蛋白酶基因bcp，其全长为1143bp，编码性蛋白酶BCP的380个氨基酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明的另一方面，还提供了一种碱性蛋白酶BCP，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。通过分析，基因bcp编码的碱性蛋白酶BCP可以分成三段，前27个氨基酸为其信号肽序列，28位氨基酸到111位氨基酸为其前导肽，112位氨基酸到269位氨基酸为其成熟肽(请确认，此处是否需要修改)。