[发明专利]一种提高毕赤酵母碳源转化率的基因工程改进方法

说明书

本发明公开了一种提高毕赤酵母碳源转化率的基因工程改进方法，属于基因工程技术领域。本发明在毕赤酵母GS115中同时敲除或沉默表达1,3‑β‑D‑葡聚糖合酶相关基因PAS_chr2‑1_0661和α‑1,2‑甘露糖转移酶相关基因PAS_chr3_0370，使构建的基因工程菌的碳源转化率较原始菌株提高2.23～2.41倍。在同样的发酵条件下，本发明构建的底盘细胞Pichia pastoris GS115ΔPAS_chr3_0370ΔPAS_chr2‑1_0661相比Pichia pastoris GS115消耗的碳源更少，菌体生长速率更快，同时，也不影响外源蛋白的表达量，更适用于高密度发酵。

技术领域

本发明涉及一种提高毕赤酵母碳源转化率的基因工程改进方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

常用的蛋白表达系统包括大肠杆菌表达系统、哺乳动物细胞、昆虫表达系统、酿酒酵母表达系统和毕赤酵母表达系统。大肠杆菌表达系统不能表达复杂蛋白质，且外源表达产量较低。哺乳动物细胞、昆虫表达系统的操作较复杂，表达水平低，并且生产成本高，不适合大规模推广。酿酒酵母表达系统不够稳定，表达过程中外源质粒易丢失，且分泌效率差。在表达外源蛋白方面，与其他表达系统相比毕赤酵母表达系统具有显著的优势。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)外源基因表达系统是一种广泛运用的表达系统，P.pastoris是甲醇营养型酵母，它能够利用甲醇作为唯一碳源和能源。巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)是一种单细胞的真核生物，易于对其进行分子遗传学操作，它的适应性很强，易培养。当外源基因导入P.pastoris时，可以整合到P.pastoris基因组上，随着染色体一起复制和遗传，外源基因丢失率低。P.pastoris具有醇氧化酶基因启动子，有强诱导性和强启动性，它又可以在培养基中快速生长，达到高细胞浓度，非常适用于外源基因的高水平诱导表达。并且P.pastoris在表达外源蛋白的同时，自身分泌的蛋白量很少，有利于后续提纯外源蛋白同时其自身产物的积累对宿主菌产生的毒副作用较小，适用于大规模的高密度发酵。

近几十年来，生物制药领域将大规模培养毕赤酵母作为关键技术之一，该技术不断推动生物产业的发展。目前，越来越多研究者优先选择毕赤酵母作为外源蛋白的表达系统，已有5000多种外源蛋白在毕赤酵母表达系统中成功表达，如白介素、干扰素、抗体等，其中70多种外源蛋白已经商业化生产。提高毕赤酵母表达系统的商业价值成为目前的研究热点。华南理工大学相关实验室曾通过敲除P.pastoris GS115α-1,2-甘露糖转移酶PAS_chr3_0370来进行脂肪酶表面展示效率的研究，但未对菌株的生长情况和碳源得率进行研究。

发明内容

[技术问题]

毕赤酵母的碳源转化率较低，从而影响了细胞的生长速率和目的产物的产量，本发明要提高碳源转化率，进而提高产物产量降低生产成本。

[技术方案]

本发明的第一目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌以毕赤酵母(Pichiapastoris)为出发菌株，不表达1,3-β-D-葡聚糖合酶和α-1,2-甘露糖转移酶。

在一种实施方式中，所述毕赤酵母为毕赤酵母Pichia pastoris GS115或毕赤酵母Pichia pastorisX33。

在一种实施方式中，编码1,3-β-D-葡聚糖合酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，编码α-1,2-甘露糖转移酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，上述基因工程菌进一步表达目的基因。