[发明专利]一种检测人博卡病毒全基因组的引物组合及其检测方法

说明书

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种检测人博卡病毒全基因组的引物组合及其检测方法。本发明提供一种用于人博卡病毒全基因组检测的引物组合，其包括12对引物，所述12对引物具有如SEQ ID NO.1‑24所示的核苷酸序列。上述引物组合能够覆盖人博卡病毒的全基因组序列约98％以上区域，具有人博卡病毒特异性，且对于不同的人博卡病毒具有通用性；上述引物组合可实现在一个PCR反应体系中进行多重PCR一步扩增人博卡病毒的全基因组，灵敏度高，可快速构建博卡病毒基因组文库，用于高通量测序。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种检测人博卡病毒全基因组的引物组合及其检测方法。

背景技术

人博卡病毒(Bocavirus)是细小病毒科、细小病毒亚科成员，是一种无包膜的单链DNA病毒。人博卡病毒可引起儿童呼吸道感染和腹泻。

目前已有的关于博卡病毒的分子检测技术主要有两类：一类是通过荧光PCR，采用博卡病毒特异性引物及探针，检测样本中博卡病毒载量，该方法只能鉴定样本中是否含有博卡病毒，无法确定具体亚型；另一类是通过多重PCR扩增病毒某个基因(例如：NP1基因或VP1基因)或连接区域(如VP1-VP2基因及连接区域)，检测病毒约500-800bp区域，以确定具体亚型，该方法无法准确地鉴定病毒的亚型，也无法全面覆盖博卡病毒基因组，因此会遗漏非覆盖区域变异，影响检测结果，较难用于流行病学研究。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种检测人博卡病毒全基因组的引物组合。本发明的另一目的是提供检测人博卡病毒全基因组的方法。

本发明通过对GenBank数据库中155种博卡病毒全基因组序列进行分析和处理，选择其中对于人博卡病毒特异的、且在不同的人博卡病毒中保守性较高的区域设计能够基本覆盖人博卡病毒全基因组的引物。进一步地，本发明通过对引物序列进行筛选、优化，使得各引物对的扩增效率相当，减少多重PCR扩增时引物之间的相互影响，实现了覆盖人博卡病毒基因组98％以上区域的12对引物能够在同一个PCR体系中进行多重PCR扩增，靶向富集博卡病毒的全基因组，更为准确、高效地检测人博卡病毒的全基因组。

具体地，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种用于人博卡病毒全基因组检测的引物组合，其包括12对引物，所述12对引物具有如SEQ ID NO.1-24所示的核苷酸序列。

上述(1)中的12对引物依次为：序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物对、序列如SEQID NO.3-4所示的引物对、序列如SEQ ID NO.5-6所示的引物对、序列如SEQ ID NO.7-8所示的引物对、序列如SEQ ID NO.9-10所示的引物对、序列如SEQ ID NO.11-12所示的引物对、序列如SEQ ID NO.13-14所示的引物对、序列如SEQ ID NO.15-16所示的引物对、序列如SEQID NO.17-18所示的引物对、序列如SEQ ID NO.19-20所示的引物对、序列如SEQ ID NO.21-22所示的引物对、序列如SEQ ID NO.23-24所示的引物对。

上述12对引物能够覆盖人博卡病毒基因组98％以上区域，且能够在同一PCR反应体系中进行多重PCR扩增，实现人博卡病毒基因组的快速富集和测序。

为方便后续文库构建时的Barcode引物扩增，可在上述12对引物的5’端添加能够与Barcode序列配对的通用序列。

作为本发明的一种实施方式，在正向引物的5’端添加序列如SEQ ID NO.25所示的通用序列，在反向引物的5’端添加序列如SEQ ID NO.26所示的通用序列。

在上述12对引物的基础上，本发明还提供另一种用于人博卡病毒全基因组检测的引物组合，其包括12对引物，所述12对引物为在具有如SEQ ID NO.1-24所示的核苷酸序列的引物组合的基础上，将其中一个或多个引物中的一个或多个碱基替换为简并碱基。