[发明专利]一种婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌的检测方法

说明书

本发明涉及一种婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌的检测方法，属于生物制品的检测技术领域。创新在于改进了婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌的富集与分离。采用液体培养基（干燥损伤修复因子为甘露醇0.4‑0.8 g/L、海藻糖2.5‑5.0 g/L；选择性富集因子为蔗糖80‑150 g/L、万古霉素4‑8 g/L、脱氧胆酸钠0.3‑0.6 g/L）进行高效富集，固体培养基（选择性成分为脱氧胆酸钠0.5‑1.0 g/L、5‑溴‑4‑氯‑3‑吲哚‑D‑ɑ‑葡萄糖苷80‑100 mg/L）进行选择性分离。本发明富集效率高、选择性强、操作方便、耗时短等优点，克服了现有检测方法耗时长、富集效果不高、操作繁琐等缺陷。本发明适合配方奶粉中克罗诺杆菌的检测，缩短检测时间，提高检测准确性及效率，降低检测成本，保障婴幼儿配方奶粉的安全性具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物制品的检测技术领域，涉及一种婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌的检测方法。

背景技术

克罗诺杆菌是一种重要食源性致病菌，能导致新生婴幼儿脑膜炎、致死性结肠炎和菌血症等，流行病数据调查表明婴幼儿配方奶粉是其感染疾病的主要传播媒介，因此克罗诺杆菌是婴幼儿配方奶粉中的必检项目。

目前，我国食品安全国家标准GB4789.40-2016和美国食品药品监督管理局（FDA）检测婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌检测方法，经过基础培养基的细菌富集培养、选择性培养基富集克罗诺杆菌、固体培养基的选择性分离及生化鉴定，大约耗时6-8天。研究发现，FDA推荐的VRBGA和EE等培养基选择性较差，不能有效筛选出克罗诺杆菌，造成假阴性结果。我国国家食品安全标准GB4789.40-2016中，部分克罗诺杆菌在万古霉素的mLST-Vm中，高温44 ℃-45 ℃被抑制而无法生长，同样易导致假阴性结果的出现。可见，现有的检测方法耗时长，培养基富集及选择性效果差，易导致假阴性结果。

现有的标准检测方法都利用克罗诺杆菌菌株具有ɑ-葡萄糖苷活性，在培养基中加入5-溴-4-氯-3-吲哚-D-ɑ-葡萄糖苷能在ɑ-葡萄糖苷酶作用下产生5-溴-4-氯-3-吲哚酚显色基团，表现为平板上形成特异性的蓝绿色菌落，但是进一步研究发现其他菌株如伤口埃希氏菌、普通变性杆菌及泛菌属等细菌亦能产生相似的特征性蓝绿色菌落，因此现有显色培养基仍无法有效区分克罗诺杆菌和其他杂菌的目的，导致显色培养基表面疑似克罗诺杆菌过多，大量耗费后续生化鉴定的人力和物力。因此，通过创新克罗诺杆菌高效富集与选择性分离的培养基配方，改进克罗诺杆菌的检测方法，对缩短婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌的检测时间，提高克罗诺杆菌的检出率，降低克罗诺杆菌检测成本，具有重要的实际意义。

发明内容

为了克服现有检测方法的缺陷，达到对配方奶粉中克罗诺杆菌的快速准确检测，本发明提供一种婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌的检测方法。

一种婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌的检测操作步骤如下：

（1）被检测物的增菌与克罗诺杆菌富集培养

（1.1）将100 g被检测物加入到900 mL的液体培养基Ⅰ中，37 ℃恒温培养6-8 h，得到增菌培养物；

所述的被检测物为婴幼儿配方奶粉；

液体培养基Ⅰ由15 g蛋白胨、1.5 g磷酸二氢钾、3.5 g磷酸二氢钠、0.4-0.8 g甘露醇、2.5-5.0 g海藻糖、5 g氯化钠和1000 mL水混合均匀制成；

（1.2）将10 mL增菌培养物加入到90 mL的液体培养基Ⅱ中，37 ℃恒温培养10 h，得到富集培养物；

所述液体培养基Ⅱ由15 g蛋白胨、1.5 g磷酸二氢钾、3.5 g磷酸二氢钠、0.4-0.8g甘露醇、2.5-5.0 g海藻糖、80-150 g蔗糖、5 g氯化钠、0.3-0.6 g脱氧胆酸钠、4-8 mg万古霉素和1000 mL水混合均匀制成；

所述万古霉素为浓度10 mg/mL的盐酸万古霉素溶液；