[发明专利]一种基因、重组载体、工程菌及其应用

说明书

本申请公开了一种基因、重组载体、工程菌及其应用。一种柠檬烯合酶LS基因，所述柠檬烯合酶LS基因选自如下a1)或a2)所示的DNA片段；a1)编码链的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA片段；a2)与a1)限定的DNA片段具有90％或以上同一性且编码具有相同功能的蛋白质的DNA片段。所述柠檬烯合酶LS基因为经过优化的柠檬烯合酶LS基因，可以在宿主细胞中顺利表达。

技术领域

本申请涉及一种基因、重组载体、工程菌及其应用，属于本发明属于基因工程领域。

背景技术

柠檬烯是一种天然的功能单萜。普遍存在于植物中，且是构成某些植物香精、树脂、色素等的主要成分。此外，柠檬烯是芳樟醇、香芹醇、紫苏醇、薄荷醇等的生物合成前体。因柠檬烯及其衍生物香气怡人、具有独特的生物活性和良好的理化性质等特点，被广泛应用于食品、饮料、保健品、医药、化妆品、生物材料、生物燃料等高附加值精细化工行业。

柠檬烯的生产方法主要有植物提取和化学合成两种。从植物源中分离出来的柠檬烯丰度或产量较低，且该方法提取效率低，反应条件苛刻，设备昂贵，这在经济上是不可行的。由于设备和原料的限制，化学合成柠檬烯不仅效率低、成本高、获得单一对映体较为困难，而且由于能源的消耗也会造成环境问题。微生物法生产柠檬烯具有先天优势，目前最主要的是克服柠檬烯对底盘微生物的毒性问题，随着生物技术的快速发展，通过代谢工程改造微生物生产柠檬烯已成为一个有潜力的替代。

先前的研究主要集中在对大肠杆菌和酿酒酵母两种常规菌株及非常规菌株解脂耶氏的改造，但产量都不是很高。如2019年，Dudley研究组将柠檬烯生物合成途径在大肠杆菌中过表达，裂解细胞等到途径酶，以葡萄糖作为底物进行柠檬烯的无细胞生物合成，并对辅因子水平进行调节，最终得到90.2mg/L的柠檬烯(Dudley Q M,Nash C J,Jewett MC.Cell-free biosynthesis of limonene using enzyme-enriched Escherichia colilysates.Synth Biol,2019,4(1):ysz003.)；Rolf研究组将来自留兰香的柠檬烯合酶和甲羟戊酸途径引入大肠杆菌，以苯二甲酸二异壬酯作为原位萃取剂进行补料分批发酵，得到7.3g/L_org的柠檬烯，这是迄今为止最高的产量(Rolf J,Julsing M K,Rosenthal K,etal.A Gram-Scale Limonene Production Process with Engineered Escherichiacoli.Molecules,2020,25(8):1881-1892.)。Hu研究组在酿酒酵母引入来自柠檬的d-柠檬烯合酶及过表达内源性香叶基二磷酸合酶基因(ERG20)及其变体ERG20^F96W-N127W增加流向柠檬烯的代谢通量，对发酵条件进行优化后得到23.7mg/L d-柠檬烯(Hu Z,Lin L,Li H,etal.Engineering Saccharomyces cerevisiae for production of the valuablemonoterpene d-limonene during Chinese Baijiu fermentation.J Ino MicrobiolBiot,2020,47(1).)；Dusseaux研究组将甲羟戊酸途径及柠檬烯合成途径定位到过氧化物酶体上，利用细胞器的分区作用，将柠檬烯的生物合成隔离开，使更多的代谢流流向目标产物，构建的平台菌株还能够有效的合成其他萜类物质(如香叶醇、桧烯、单帖吲哚生物碱等)，最终通过分批补料发酵得到2.58g/L柠檬烯(Dusseaux S,Wajn W T,Liu Y,etal.Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficientproduction of high-value isoprenoids.Proc Natl Acad Sci U S A,2020,117(50):31789-31799.)。Cheng研究组将柠檬烯合成途径引入解脂耶氏酵母，并对柠檬烯合成途径、甲羟戊酸途径及培养基进行优化，得到的高产菌株进行分批补料发酵，产生165.3mg/L的柠檬烯(Cheng B Q,Wei L J,Lv Y B,et al.Elevating Limonene Production inOleaginous Yeast Yarrowia lipolytica via Genetic Engineering of LimoneneBiosynthesis Pathway and Optimization of Medium Composition.BiotechnologyBioproc E,2019,24(3):500-506.)。大肠杆菌虽然柠檬烯的产量很高，但大肠杆菌中的质粒是以游离形式存在，导致菌株鲁棒性不好，不适合工业使用；基因通过整合到酵母基因组上可以提高其稳定性，但通过此种方式改造的酵母菌株生物合成柠檬烯的能力还较低，限制了柠檬烯的工业生产，目前丞需高产柠檬烯的基因工程菌。