[发明专利]一种基于CYP82E4基因表达水平筛选硃砂烟植株的方法

说明书

本发明涉及一种基于CYP82E4基因表达水平筛选硃砂烟植株的方法，所述的基因为CYP82E4基因；所述的方法包括以下步骤：单株挂牌编号、叶片取样、RNA提取及cDNA合成、基因表达水平检测、套袋自交收种。本发明有益效果为，利用CYP82E4基因转录本序列信息设计引物，扩增效率高，特异性强。

技术领域

本发明属于烟草遗传育种技术领域，具体涉及筛选硃砂烟植株的基因、序列及方法技术领域。

背景技术

栽培烟草(Nicotiana tabacum)是源于两个祖先种绒毛状烟草(N.tomentosiformis)和林烟草(N.sylvestris)通过种间杂交加倍而形成的异源四倍体，但其叶片主要生物碱与两个祖先迥异。大部分栽培烟草的绿色和衰老叶片中，尼古丁是主要生物碱，约占生物碱总量的90～95％。绒毛状烟草在绿色及衰老叶片中均积累去甲基尼古丁；而林烟草在绿色叶片中主要积累尼古丁，但在叶片衰老过程中大部分尼古丁转化为去甲基尼古丁。白肋烟是普通烟草的一种类型，其“非转化株”的主要生物碱为尼古丁，但每一世代群体中约有20％单株发生未知突变成为“转化株”，“转化株”中主要生物碱为去甲基尼古丁。烤烟单株也会发生类似突变，其烟叶主要累积去甲基尼古丁，且突变株烤后烟叶表面呈现红色斑点，国外学者称为“Cherry-red”，我国称之为“硃砂烟”。硃砂烟出现概率极低，有研究表明在538个单株中发现3株硃砂烟，概率约为0.56％。硃砂烟具有独特的“糯米香”，是云南地区烟民抽吸水烟筒时深受欢迎的调香原料。

尼古丁由尼古丁去甲基酶催化产生去甲基尼古丁，目前烟草基因组中尼古丁去甲基酶基因家族共有4个功能基因被克隆，分别为CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10、CYP82E21。CYP82E21基因虽能编码具有活性的尼古丁去甲基酶，但仅在花药中表达，不影响叶片去甲基尼古丁含量。研究表明白肋烟“转化株”中CYP82E5、CYP82E10基因对去甲基尼古丁合成无明显贡献，而CYP82E4在白肋烟“转化株”受未知机制诱导高水平表达，是导致“非转化株”自发突变成“转化株”的关键基因。“非转化株”中过表达该基因可以显著提高叶片尼古丁转化率(去甲基尼古丁/(尼古丁+去甲基尼古丁)*100％)，而通过RNAi抑制CYP82E4基因表达的转化株材料及CYP82E4基因EMS突变体材料的尼古丁转化率均显著下降。烤烟中CYP82E4基因表达水平极低，往往低于qPCR检测限，尼古丁去甲基反应主要由CYP82E5、CYP82E10催化。因碱谱类似白肋烟“转化株”，推测烤烟转化株(硃砂烟)中CYP82E4基因也可能被诱导高水平表达，导致其烟叶累积去甲基尼古丁作为主要生物碱。

硃砂烟叶作为特色原料，具有广泛的应用前景。但目前硃砂烟生产主要通过收购环节人工挑选具有硃砂特征的田间突变烟叶，导致烟叶产量不稳定，烟叶质量存在诸多缺陷。筛选出能够稳定遗传的硃砂烟资源是硃砂烟规模化开发的前提基础。

发明内容

由于硃砂烟与常规烤烟在生长阶段难以通过外观区分，无法筛选出硃砂烟植株并收种，造成无硃砂烟种子用于农业生产。本发明正是为了解决上述问题缺陷，本发明的目的在于提供一种筛选硃砂烟植株的基因、序列及方法。

本发明采用如下技术方案实现。

筛选硃砂烟植株的基因，本发明所述的基因为CYP82E4基因。

本发明所述的方法包括以下步骤：单株挂牌编号、叶片取样、RNA提取及cDNA合成、基因表达水平检测、套袋自交收种。

本发明上述方法的步骤具体为：

步骤(1)单株挂牌编号：所有待筛烟草单株挂牌，并标记唯一编号；

步骤(2)叶片取样：取烟株幼嫩叶片组织0.1g左右置于液氮保存；

步骤(3)RNA提取及cDNA合成：提取叶片组织总RNA，并反转录成cDNA；