[发明专利]鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’的多重SSR标记引物及方法

说明书

本发明涉及一种鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’品种的分子特征性多重荧光SSR标记引物组及方法。所述分子特征性多重荧光SSR引物如下：引物Cg_U213：上游引物Cg_U213F：5′‑FAM‑AAGAGAAAGGGAGACCGAGC‑3′，下游引物Cg_U213R：5′‑CTCTCCCTCTCACGTTCCAG‑3′；引物CT02：上游引物CT02F：5′‑HEX‑ACGGTGCGTTTTGAGGTAAG‑3′，下游引物CT02R：5′‑TGACTGTTGGATTTGGGATG‑3′；本发明所述的分子特征性多重荧光SSR引物可利用幼叶DNA对特早熟玉环柚‘早玉文旦’进行快速的早期鉴别，同时也可对柚类品种葡萄柚、红心柚、早香柚和玉环文旦进行鉴别，方法简单、快捷、准确，是传统方法即在挂果后根据果实形态学特征鉴别柚类品种所不能替代的高效分子手段。

(一)技术领域

本发明涉及一种快速鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’优良品种的分子特征性多重荧光SSR标记引物及方法。

(二)背景技术

中国是柚类起源中心之一，栽培历史悠久，种质资源丰富，形成了包括福建、浙江、中国台湾的东南沿海柚产区，和以广西及广东为主的华南柚区和以四川、重庆、湖南、贵州为主的西南柚区。浙江省作为东南沿海柚区重要组成之一，舟山、丽水、台州、温州等地具有许多特征明显的地方资源。

早熟玉环柚‘早玉文旦’是玉环县近年来出现的一个优良栽培品种，相比普通玉环柚可以提早一个半月上市，含糖高、化渣好，酸甜适中、丰产性和适应性强，2015年普通玉环柚平均每斤1.9元，特早熟玉环柚每斤 8元；2016年普通玉环柚平均每斤4.5元，特早熟玉环柚每斤12元，且供不应求。农户经营特早熟玉环柚获得的经济效益相比经营普通玉环柚更好。目前特早熟玉环柚和普通玉环柚间的种质差异需等到挂果后才可以鉴别，很大程度上影响了玉环柚苗木的繁育周期和品种间鉴定。

柚类种质和品种资源繁多，现有的鉴别方法包括从叶片或果实形态学和生物化学方法对柚类品种(系)的鉴定和识别过程较为困难和复杂，准确度不高，成本较高且耗时耗力。尽管高光谱成像技术可用于柚类品种的鉴别，但数据波段数众多，数据量大，建模的计算工作量繁琐，直接影响建模的速度，而且光谱间存在强相关性，冗余信息多，影响建模的精度和稳定性。因此这些方法并不真正适合于柚类品种的鉴别。

自2000年以来，基于PCR的分子标记技术如RAPD(随机扩增多态性DNA)、SRAP(相关序列扩增多态性)和SSR(简单重复序列；或 Microsatellite，微卫星)相继用于了柚类品种的亲缘关系和遗传多样性分析。SNP(单核昔酸多态性)基因分型技术也用于了柚类品种鉴定。RAPD 和SRAP分子标记所采用的均为通用引物，需经大工作量的多态性筛选，而且PCR扩增图谱复杂、重复性较差，引物的特异性不高。利用SNP基因分型技术鉴定柚类品种存在的问题是SNP位点的获得较难，且单个 SNP分子标记的多态信息含量较低。基于SNP的等位基因特异性PCR法 (AS-PCR)在操作过程中对反应条件比较敏感，易发生非特异性扩增导致假阳性，易产生大量引物二聚体导致PCR失败；基于SNP的高分辨率熔解曲线法(HRMA)分析仪器昂贵，试剂成本较高。因此这些分子生物学技术也不是柚类品种鉴定的理想选择。

荧光SSR标记的开发是基于DNA测序平台的毛细管电泳检测方法，是以不同颜色的荧光基团(如FAM、HEX、TAMRA等)来标记一对SSR 引物中的一个引物末端，利用荧光检测器对产物检测，达到自动识别扩增产物的大小，克服了传统银染法聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的不足，具有快速、高效、精确、灵敏等技术优势。荧光多重SSR标记技术则进一步结合了多重PCR(Multiplex PCR)与荧光SSR标记二项技术的优点，可以在一个PCR反应体系中加入多对SSR引物组合，同时检测出多个基因型，从而解决了在进行大批量、多批次检测时的费时费力以及成本高的缺陷。因此，利用荧光多重SSR标记技术开发柚类新品种或优良、特色品种的特征SSR指纹(基因型组合)，揭示特早熟玉环柚与其他柚类品种间的基因型差异，对于‘早玉文旦’优良品种的鉴别与知识产权保护具有重要意义。

(三)发明内容