[发明专利]鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’的多重SSR标记引物及方法

权利要求书

1.鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’品种的分子特征性多重荧光SSR标记引物，其核苷酸序列如下：

引物Cg_U213：

上游引物Cg_U213F：5′-FAM-AAGAGAAAGGGAGACCGAGC-3′

下游引物Cg_U213R：5′-CTCTCCCTCTCACGTTCCAG-3′；

引物CT02：

上游引物CT02F：5′-HEX-ACGGTGCGTTTTGAGGTAAG-3′

下游引物CT02R：5′-TGACTGTTGGATTTGGGATG-3′。

2.一种快速鉴别鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’品种的方法，所述方法包括：提取待测柚类品种幼嫩叶片的基因组DNA作为模板，以分子特征性多重荧光SSR引物作为扩增引物，进行多重PCR扩增，对扩增产物进行毛细管电泳检测，若荧光毛细管电泳峰图上出现的基因型为256/256和136/140，则待测柚类品种为特早熟玉环柚‘早玉文旦’；若出现的基因型为250/250和136/140、256/262和136/140、250/262和136/140以及256/256和136/136，则待测柚类品种分别为葡萄柚、红心柚、早香柚和玉环文旦；

所述分子特征性多重荧光SSR引物如下：

引物Cg_U213：

上游引物Cg_U213F：5′-FAM-AAGAGAAAGGGAGACCGAGC-3′

下游引物Cg_U213R：5′-CTCTCCCTCTCACGTTCCAG-3′；

引物CT02：

上游引物CT02F：5′-HEX-ACGGTGCGTTTTGAGGTAAG-3′

下游引物CT02R：5′-TGACTGTTGGATTTGGGATG-3′。

3.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR扩增反应条件如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，57.6℃退火15s，72℃延伸15s，共35个循环；最后于72℃补平2min，终止温度为4℃。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述荧光毛细管电泳检测方法如下：将PCR扩增产物稀释后于96℃变性5min，将变性后的稀释产物在-20℃下迅速冷冻2min后置入ABI3730 XL Genetic Analyzer分析仪，与内标GeneScan^TM-500 LIZ Size Standard同步进行毛细管电泳检测，用Data Collection 3.0软件收集数据。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)取待测柚类品种幼嫩针叶，加液氮磨碎，提取柚类的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特征性多重荧光SSR引物为扩增引物，进行多重PCR扩增：

PCR反应体系每25μL组成如下：

多重PCR反应条件如下：

98℃预变性2min；98℃变性10s，57.6℃退火15s，72℃延伸15s，共35个循环；最后于72℃补平2min，终止温度为4℃；

(3)内标配制：取10ml Hi-Di和80μLGeneScan^TM-500 LIZ Size Standard混匀，离心，以每孔10μL分装于96孔内标板，离心；将PCR扩增产物稀释，离心；取稀释产物按0.5μL/孔加入到分配好的96孔内标板中，混匀，离心，置入PCR仪，于96℃变性5min，之后在-20℃下迅速冷冻2min，离心，得到变性后的PCR产物将变性后的PCR产物与内标同步置入ABI 3730 XLGenetic Analyzer进行毛细管电泳检测，用Data Collection 3.0软件收集数据；

(4)数据分析：用GeneMapper 4.1软件对Data Collection 3.0软件收集的原始数据进行分析，软件系统将根据目标峰的位置与同一泳道中的内标GeneScan^TM-500 LIZ SizeStandard进行比较，直接读出目标SSR片段的准确峰值，等位变异数据记录为X/X；

(5)结果判断：若荧光毛细管电泳峰图上出现的基因型为256/256和136/140，则待测柚类品种为特早熟玉环柚‘早玉文旦’；若出现的基因型为250/250和136/140、256/262和136/140、250/262和136/140以及256/256和136/136，则待测柚类品种分别为葡萄柚、红心柚、早香柚和玉环文旦。