[发明专利]一种用于cas12a编辑DNA的缓冲液及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于cas12a编辑DNA的缓冲液及其制备方法和应用，所述缓冲液包括如下原料：5‑25mM的HEPES，pH6.8‑7.7，80‑300mM的KCl，5‑20mM的MgCl₂，0.5％‑2％的甘油以及0.3‑0.7mM的DTT。配制所需浓度的HEPES溶液，调节pH，然后按照所需浓度，依次加入KCl、MgCl₂、甘油和DTT，混合均匀，即得所述缓冲液。本发明中的HEPES属于高纯生物缓冲剂，不会对反应各组分造成降解等影响；本发明的缓冲液可使cas12a检测乙型流感DNA灵敏度增加10‑100倍，灵敏度最高可达100fM；本发明制备工艺简单，操作方便，具有较高的实用性。

技术领域

本发明属于DNA编辑缓冲液技术领域，具体涉及一种用于cas12a编辑DNA的缓冲液及其制备方法和应用。

背景技术

目前为止已发现6种类型和超过20种的CRISPR-Cas系统亚型。其中， CRISPR-Cas12a是第二类(V型)用于编辑哺乳动物基因组的CRISPR-Cas系统。Cas12a 可切割DNA，可以与CRISPR-Cas9系统进行互补。Cas12a(Cpf1)蛋白具有类似于Cas9 的RuvC内切核酸酶结构域。Cpf1不需要tracrRNA，只需要crRNA，非常有利于基因组编辑；Cas12a比Cas9小，还具有较小的crRNA分子(接近Cas9的总sgRNA的一半)；Cas12a-crRNA复合物通过识别富含T的PAM基序来切割靶DNA，与Cas9需要富含G的PAM相反。

首先，Cas12a/crRNA二元复合物识别靶标DNA序列，形成三元复合物，并在PAM 序列近端开始形成R-loop(low FRET态)。随着R-loop的进一步延伸，Cas12a蛋白的核酸酶活性被激活，并且使得非互补链(NTS)从双链DNA结构解开，将切割位点暴露出来，以完成NTS链的切割(medium FRET态)。断裂的NTS链稳定了Cas12a复合体的互补链(TS)切割构象(high FRET态)，以完成对TS链的切割。基于 CRISPR-Cas12a系统的非特异的DNA切割能力和强大的DNase活性，一个靶DNA激活的Cas12a可切割数以千计的DNA探针，对反应体系里的靶DNA进行信号放大检测。

目前，采用一般反应缓冲液进行cas12a切割乙型流感DNA，灵敏度只有10pm，无法满足实验要求。

发明内容

发明目的：为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种用于cas12a编辑DNA的缓冲液及其制备方法和应用，该缓冲液能够有效提高检测灵敏度。

技术方案：一种用于cas12a编辑DNA的缓冲液，所述缓冲液包括如下原料：

5-25mM的HEPES，pH6.8-7.7，80-300mM的KCl，5-20mM的MgCl₂，0.5％-2％的甘油以及0.3-0.7mM的DTT。

一般的反应缓冲液(40mMTris-HCl、60mMNaCl、6mM MgCl₂、pH7.5)

优选的，所述缓冲液包括如下原料：

15-25nM的HEPES，pH6.8-7.7，120-200nM的KCl，10-15nM的MgCl₂，0.8-1.1％的甘油以及0.4-0.6mM的DTT。

所述的用于cas12a编辑DNA的缓冲液的制备方法，包括以下步骤：

配制所需浓度的HEPES溶液，调节pH，然后按照所需浓度，依次加入KCl、MgCl₂、甘油和DTT，混合均匀，即得。

优选的，所述调节pH至6.8-7.7。

本发明最后还提供了所述缓冲液在cas12a编辑乙流DNA中的应用。