[发明专利]消除大肠杆菌药物耐药性的中药组方及其筛选方法与应用

说明书

本发明提供了一种组成消除耐药中药组方及筛选方法，试验选择4株多重耐药大肠杆菌作为研究对象，分别以亚抑菌浓度(1/2MIC)中药与4株菌分别共培养72h。然后采用凝胶电泳法、双纸片法、荧光定量PCR和生物膜阳性筛选方法检测细菌培养物，根据体外消除细菌耐药效果，确定消除耐药效果较好单味中药组成组方；再通过动物试验，检查各组心肝组织病理学变化，并统计各组治愈率、有效率、死亡率，并验证组方体内消除大肠杆菌耐药的效果。本发明组方山楂黄连组方+抗生素效果优于传统组方三黄汤，说明利用此种方法组成的组方治疗效果优于根据中药辩证论治组成的传统组方。

技术领域

本发明属于中药制剂技术领域，具体涉及消除大肠杆菌药物耐药性的中药组方及其筛选方法。

背景技术

近年来，大肠杆菌病在国内养禽场广泛流行，发病率和死亡率居高不下，严重威胁着养禽业发展，造成巨大经济损失。长期以来，在治疗该病过程中，抗菌药物发挥极其重要作用。但抗菌药物广泛、持续和不合理使用，加大耐药大肠杆菌尤其是产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌的产生和扩散，造成药物治疗效果不理想，已成为阻碍养禽业发展的难题之一。由此可见，细菌产生耐药性是导致上述结果的主要原因。因此降低大肠杆菌耐药性，恢复对部分或全部抗生素的敏感性对于临床治疗细菌感染及防止细菌耐药性传播具有重要意义。降低细菌耐药性有多种途径，其中低毒、成本低廉的中药和天然植物备而受关注，因此，利用中药消除鸡源大肠杆菌耐药性成为一个可深入探索的研究方向。

中药通过消除R质粒、抑制ESBLs活性、影响细菌生长速度和蛋白表达量、抑制主动外排系统和细菌生物膜形成等作用机制，使细菌恢复对抗菌素敏感性。研究表明，中药可改变大肠杆菌特异性耐药基因和非特异性耐药基因的转录和翻译水平，从根本上逆转细菌的耐药性。然而细菌多重耐药机制证明多重耐药是由多种因素决定的，单一的逆转制剂不可能抑制所有的耐药机制，多种逆转制剂联合应用针对多重耐药机制可能更有效。通过这种策略，即组合单体或复合天然提取物可以发挥协同对抗作用并且影响药物多靶点。目前中药配伍遵循中药辩证论治结合中兽医传统理论，而本发明针对不同耐药机制，可全方位、多角度的消除细菌多重耐药性，延长抗生素使用寿命。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，提供一种安全有效地用来消除对鸡源大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药的中药组合物及其筛选方法。

本发明采用的技术方案为：一种消除大肠杆菌药物耐药性的中药组方筛选方法，包括以下步骤：

A、根据消除大肠杆菌耐药机制筛选单味中药，所述耐药机制主要包括R质粒介导、产生ESBLs、通过主动外排系统和形成生物膜；

B、采用凝胶电泳方法筛选消除R质粒的单味中药；

C、利用双纸片法筛选抑制ESBLs活性的单味中药；

D、利用荧光定量PCR方法筛选降低外排系统基因Acra-mRNA、Acrb-mRNA表达量的单味中药；

E、利用生物膜阳性筛选方法，筛选出降低生物膜黏附性的单味中药；

F、将步骤B-E中筛选出的单味中药组成中药组合物。

进一步地，所述筛选方法还包括：

A-1、中药水提物制备：将单味中药浸泡30min，文火熬制2次，合并浓缩、过滤除菌，浓度为1g/mL以生药计，得到单味中药水提物；

A-2、大肠杆菌菌液制备：将冷冻保存菌液接种于LB液体培养基中，37℃培养过夜，将活化菌液划线接种于麦康凯琼脂平板，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37℃培养过夜，得到大肠杆菌液。

一种消除大肠杆菌药物耐药性的中药组方，所述中药组合物为山楂1份和黄连1份，所述中药组合物与抗生素联合使用，所述抗生素为头孢噻肟，所述抗生素与中药组合物的重量份数比为(2～5)：10。