[发明专利]一种人参皂苷Rh2的制备方法

说明书

本发明公开了一种人参皂苷Rh2的制备方法，该方法是将基因DS和转录因子基因PnWRKY同时转入烟草中获得合成人参皂苷Rh2的转基因烟草，其中基因DS的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，转录因子基因PnWRKY的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；本发明方法获得的转基因植株能够合成人参皂苷Rh2；且本发明方法简单，易操作，适于规模化生产和市场推广应用，本发明为获取人参皂苷Rh2提供了新途径。

技术领域

本发明涉及一种人参皂苷Rh2制备方法，属于生物医药制备技术领域。

背景技术

人参皂苷Rh2是一种稀有人参皂苷，人参皂苷Rh2对免疫系统、中枢神经系统、内分泌系统、心血管系统等均有调节作用，具有抗肿瘤、抗过敏、抗抑郁、抗衰老及改善心肌缺血等功效。在抗肿瘤方面，Rh2不但可以通过促进肿瘤细胞凋亡、阻滞肿瘤细胞周期等机制抑制多种肿瘤的发展，还可以增强机体抗肿瘤免疫应答、改善化疗药的免疫抑制作用。Rh2还有显著的抗炎作用，可以抑制脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导的炎症反应，并对阿尔兹海默症、过敏性哮喘、过敏性皮炎等具有潜在治疗作用。

Rh2最早发现于红参中，后来亦在西洋参、三七等多种中药中分离得到，人参提取物中人参皂苷Rh2的含量极微。目前，人参皂苷Rh2主要通过PPD型人参皂苷脱糖基产生；但是，人参属药材栽培时间长(3-10年)，药材中PPD型人参皂苷的含量低，以及生物转化法的酶解效率不高等原因，使得人参皂苷Rh2的价格较高，其在医药和保健行业的应用受到一定限制。

植物中转录因子可以正调控或负调控次生代谢物合成途径中多个关键酶基因，调控转录因子基因相比于多基因操作更易促进目标次生代谢物的生物合成。植物中的转录因子可同时调控多个功能基因的表达，因此导入一个关键转录因子，有可能控制多个功能基因同时起作用，从而改变植物次代谢产物的合成。随着对植物次级代谢途径和调节机制的认识，基于转录因子具有协调控制次生代谢物生物合成途径中多个功能相关基因转录的功能，可以通过操纵转录因子实现对关键酶基因的“多点调控”，进而影响次生代谢产物的生物合成。

人参皂苷Rh2的生物合成途径已基本清楚。2,3-氧化角鲨烯在达玛烯二醇合成酶（DS）的作用下生成达玛烯二醇，达玛烯二醇在CYP450的作用下C-6位被羟基化生成原人参二醇，再通过糖基转移酶糖基化C-3位的羟基生成人参皂苷Rh2。但是，利用化学方法使结构复杂的PPD型皂苷糖基化暂时难以实现。

烟草是栽培技术成熟的经济作物，体内具有丰富的酶修饰系统，并且烟草具备成熟的转基因技术体系。尽管烟草可能具备合成天然化合物的潜力，但尚未见到在烟草中合成人参皂苷Rh2的报道，且烟草基因组中没有合成包括人参皂苷Rh2在内的达玛烷型四环三萜皂苷的完整通路，烟草本身不具有此类皂苷的合成能力。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种人参皂苷Rh2的制备方法，即将基因DS和转录因子基因PnWRKY同时转入烟草中获得合成人参皂苷Rh2的转基因烟草，其中基因DS的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，转录因子基因PnWRKY的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；本发明方法在在烟草中构建合成人参皂苷Rh2的途径，从而采用烟草产生人参皂苷Rh2。

本发明目的通过以下技术方案实现：

（1）从三七（Panax notoginseng）根部提取总RNA，逆转录合成三七cDNA，以合成的第一链cDNA为模板，通过PCR扩增三七基因DS和转录因子基因PnWRKY，扩增引物如下：