[发明专利]一种猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗及其生产方法

权利要求书

1.一种猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗的生产方法，其包括向悬浮培养的BHK-21细胞中接种猪伪狂犬毒株JS-2012株的gE基因缺失毒株JS-2012ΔgE种毒获得病毒液，和对获得的病毒液进行澄清、先灭活后浓缩纯化以及乳化配苗处理生产获得猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗；其中所述灭活处理中采用BEI作为灭活剂。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其中所述灭活处理的具体操作为：向经澄清的病毒液中加入BEI，使BEI的终浓度为0.002～0.004mol/L，待温度升至30～35℃时开始计时，灭活24～35小时，期间每隔60～120分钟搅拌一次，计时结束后，使用终浓度为2％～4％的硫代硫酸钠阻断灭活。

3.根据权利要求1或2所述的生产方法，其中所述JS-2012ΔgE种毒的获得方式为：在BHK-21悬浮细胞中连续悬浮培养毒株JS-2012ΔgE至传代12代次以上获得；其中所述培养的条件为：在36.5℃±0.5℃，pH值6.5～7.5，搅拌转速80rpm～150rpm，溶解氧浓度30％～60％下培养至细胞活率小于50％或培养48～60小时。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的生产方法，其中所述悬浮培养的BHK-21细胞的密度为1.8～3.0×10⁶个/ml。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的生产方法，其中所述获得病毒液的具体操作为：按体积百分比为0.5％～1％向悬浮培养的BHK-21细胞中接种JS-2012ΔgE种毒，在36.5℃±0.5℃，pH值6.5～7.5，搅拌转速80rpm～150rpm，溶解氧浓度30％～60％下悬浮培养，待细胞活率小于50％时或培养48～60小时收获病毒液。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的生产方法，其中对病毒液进行澄清、先灭活后浓缩纯化以及乳化配苗处理的具体操作为：

澄清：将获得的病毒液用已灭菌澄清过滤器(0.45μm)预处理病毒液或用连续流离心机离心，获得病毒澄清液；

灭活：向病毒澄清液中加入BEI作为灭活剂，使BEI的终浓度为0.002～0.004mol/L，待温度升至30～35℃时开始计时，灭活24～35小时，期间每隔60～120分钟搅拌一次，计时结束后，使用终浓度为2％～4％的硫代硫酸钠阻断灭活，获得灭活病毒液；

浓缩纯化：用450KD～550KD的中空纤维柱或膜包系统将灭活病毒液进行5～10倍浓缩，再用等体积PBS进行洗滤，取浓缩并洗滤后的病毒液，加入体积浓度为9％～13％的PEG6000后于3～5℃振荡2～6h后静置过夜，经高速冷冻离心(4℃，6000～10000r/min离心20～40min)后，弃掉离心上清，将沉淀用PBS(pH为7.2～7.4，浓度为0.04mol/L)按浓缩后体积重悬，获得配苗用病毒抗原液；

乳化配苗：将配苗用病毒抗原液作为水相，加入油相中进行混合乳化操作，分装获得猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗。

7.根据权利要求6所述的产方法，其中在乳化配苗步骤中，所述油相为ISA201佐剂，所述油相和水相按照质量比为1:1或者按照体积比为54:46的比例配比。

8.一种猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗，其由权利要求1-7中任一项所述的生产方法获得，配苗用病毒抗原液中病毒含量为10^7.0TCID₅₀/0.1mL以上，所述猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗在2～8℃条件下的保存期为18个月以上。

9.根据权利要求8所述的猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗，其使用的疫苗株为毒株JS-2012ΔgE。

10.根据权利要求8或9所述的猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗，制苗中使用的灭活剂为BEI。