[发明专利]一种α亚基突变的腈水合酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种α亚基突变的腈水合酶突变体及其应用。本发明通过蛋白质分子改造，显著提高了源于博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM12804)的腈水合酶在基因工程菌E.coli BL21(DE3)中活性表达能力。以丙烯腈为底物，本发明的腈水合酶突变体的催化活力显著提高，单位LB摇瓶发酵液的酶活最高为突变体NHAB‑A2M，为初始型NHAB的1.7倍；突变体NHAB‑A14M的酶活提高了1.4倍，其热稳定性更是显著提高，在45℃条件下热处理1h后，残余酶活为78％，是野生型的4.8倍。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种α亚基突变的腈水合酶突变体及其应用。

背景技术

腈水合酶(Nitrile hydratase，NHase)是一类可催化腈类化合物水合生成酰胺类物质的生物催化剂。微生物生产的腈水合酶可以高效催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺；丙烯酰胺聚合生成的聚丙烯酰胺作为降阻剂、絮凝剂和增稠剂在石油开采、水处理以及造纸等方面广泛应用。

生物酶催化法制备丙烯酰胺相较于传统的化学催化法，具有转化效率高、产物纯度高、反应条件温和以及环境友好等优点，有逐步取代化学法的趋势。日本三菱公司利用含有腈水合酶的玫瑰色红球菌J1(CN91101323.7)催化丙烯腈生产丙烯酰胺，年产量达20万吨以上。但红球菌是一种野生菌，其生长周期较长、生产效率较低，并且仅在10～30℃条件下稳定，因此在实际生产应用中还是有一定限制。目前，生物酶催化法生产丙烯酰胺的研究重点在于高产腈水合酶菌株的发现以及对腈水合酶本身性能的改造提高。腈水合酶在工业应用过程中普遍存在热稳定性差的问题，而腈类的水合过程属于放热反应，反应后期催化效率严重降低，致使整个生产过程效率不高；所以在工业催化过程中，需要引入冷却装置以及其他工序，但这又会造成能源浪费，增加生产成本。

通过构建具有腈水合酶催化活性的基因工程菌株，并对腈水合酶进行蛋白质工程改造可在一定程度上解决解决丙烯酰胺生产中的实际问题。基因工程菌适应性强，发酵周期短，有利于实现大规模培养和工业化生产，且可以有效地降低生产成本。专利文献(CN104498466)公开了一种来源于博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM12804)的腈水合酶(NHAB)基因序列，其对丙烯腈有较高的催化活力，但其酶活和热稳定性仍不能满足工业化。因此，选择NHAB进行蛋白质工程改造，可获得酶活和热稳定性均有提高的腈水合酶突变体，更好地应用于丙烯酰胺的大规模生产。

发明内容

本发明针对来源于博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM12804)的腈水合酶，对其催化活性中心所在的α亚基进行理性设计，提供了3个腈水合酶突变体，不仅提高了其表达酶活，并且热稳定性也大大提高。

一种腈水合酶的α亚基突变体，由野生型α亚基序列经突变所得，野生型α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，突变位点为以下任一组：

(1)两点突变：第105位丙氨酸突变为天冬氨酸、第122位丝氨酸突变为缬氨酸；

(2)三点突变：第71位丙氨酸突变为天冬氨酸、第105位丙氨酸突变为天冬氨酸、第122位丝氨酸突变为缬氨酸；

(3)十四点突变：第30位丝氨酸突变为苏氨酸、第46位缬氨酸突变为异亮氨酸、第71位丙氨酸突变为天冬氨酸、第74位丙氨酸突变为天冬氨酸、第78位丙氨酸突变为精氨酸、第79位天冬酰胺突变为天冬氨酸、第81位丝氨酸突变为苏氨酸、第92位缬氨酸突变为精氨酸、第96位天冬氨酸突变为组氨酸、第97位苏氨酸突变为甲硫氨酸、第105位丙氨酸突变为天冬氨酸、第122位丝氨酸突变为缬氨酸、第133位丙氨酸突变为脯氨酸、第179位丙氨酸突变为谷氨酸。

本发明又公开了一种α亚基突变的腈水合酶突变体，包括α亚基和β亚基，其中，所述α亚基为所述的α亚基突变体。β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。