[发明专利]一种适用于核酸检测试剂盒冻干的冻干保护剂及其冻干方法

说明书

本发明公开了一种适用于核酸检测试剂盒冻干的冻干保护剂及其冻干方法，通过本发明提供的冻干工艺可以将各种液体核酸检测试剂盒制备成冻干制剂，使其可以完全摆脱冷链运输的限制，便于常温长途运输和常温长期储存，为各种液体核酸检测试剂盒提供了稳定的保存方法。冻干制剂具有稳定性高、使用方便的特点，冻干制剂含水量低，延长了核酸检测试剂的保质期。在本发明中对冻干所需的保护剂进行了优化，使冻干后的成品制剂性能更加稳定。

技术领域：

本发明属于生物制剂技术领域，特别涉及一种适用于各种核酸检测试剂盒进行真空冷冻干燥的冻干工艺。

背景技术：

真空冷冻干燥技术是一种水溶液在低温下冻结，而后在真空状态下将其中的水分不经过液提状态而直接升华干燥的技术，其干燥后的物质具有物理和化学性质基本不变，性状基本不变，有效成分损失小，复水性好，密封保存周期长。真空冷冻干燥技术为稳定性差的、需要冷链运输和储存的各类液体核酸检测试剂盒提供了稳定的保存方法。

在生物制品的冷冻干燥过程中，主要有三种效应会影响其中活性组分的稳定性甚至导致失活：①冻结效应：在生物制品的冻结过程中，不断结晶会导致溶液的浓度快速升高，离子浓度增加，促进了化学反应。在有些生物制品溶液的冻结过程中，溶液的PH值也会发生变化，导致蛋白质发生物理聚集和化学变性。②脱水效应：水溶液在蛋白质经过充分水合作用后，在蛋白质分子表面附着一水合层，在冷冻干燥过程中有一部分结合水会被去除，结合水的去除很可能破坏蛋白质的天然结构，最终导致蛋白质的变性。③低温效应：生物制品中活性组分在降温和升温过程的一定温度范围内会发生变性。生物制品的冷冻干燥过程是一个多步骤的复杂过程，为了防止药品和生物制品在冷冻干燥过程中关键活性组分的变性，因此在大多数的药品和生物制品的冷冻干燥过程中，都需要添加合适的冷冻干燥保护剂，配制成混合液后，才能进行有效的冷冻干燥。

在冷冻干燥过程中常用的一些保护剂主要有糖类、多元醇类、表面活性剂类、氨基酸类、其它添加剂类等。糖类：单糖（葡萄糖、半乳糖）对蛋白质的冷冻干燥过程不能起到保护作用，这是因为单糖在冻结过程中只能提供非常微弱的稳定作用，使得蛋白质在脱水干燥前就发生了不可逆变性，所以在目前的生物制品的冷冻干燥配方中，一般不单独使用单糖作为保护剂。在许多生物制品的冻干过程中，常常采用低聚糖（蔗糖、海藻糖），尤其是二糖既能在冻结过程中起低温保护剂的功能，又能在干燥脱水过程中起到脱水保护剂的作用。海藻糖是一种天然的糖类，具有相对较高的玻璃化转变温度，可以有效防止水对玻璃化态的增塑作用。在蛋白质冻干过程中，当蛋白质失水时会发生变性，海藻糖可以填补到因为失水而产生的空缺当中，从而有效的防止了冻干过程中蛋白质的变性。

多元醇（甘露醇、山梨醇、丙三醇）具有和糖类一样的作用。甘露醇在无菌溶液中性状稳定，不易被氧化。在生物制品的冷冻干燥过程中，甘露醇一般提供支持结构，用作填充剂，并且不与活性组分发生反应。山梨醇是甘露醇的同分异构体，其溶解度比甘露醇大，具有吸湿性，但高温下不稳定，在冷冻干燥配方中，山梨醇常用作填充剂。丙三醇（甘油）在冷冻干燥配方中，一般用作低温保护剂。

氨基酸类：氨基酸是蛋白质的基本构成单位，其中最主要的是a-氨基酸。常用的氨基酸类保护剂有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸和组氨酸，氨基酸是很好的填充剂。由于氨基酸离子具有酸碱两性，因此能够在生物制品的低温保存和冷冻干燥过程中抑制溶液PH值的变化，从而达到保护活性组分的目的。如低浓度甘氨酸可通过抑制10或100mmol/L磷酸缓冲盐结晶所致PH值的改变而阻止蛋白质变性，并且能升高成品的塌陷（崩解）温度，阻止因塌陷而引起的蛋白质的破坏。

聚合物类：聚合物能提高生物制品混合溶液的玻璃化转变温度，因此在有些生物制品的配方中常常加入多种聚合物类保护剂。聚合物类保护剂一般同时起着低温保护剂和脱水保护剂的作用，如：聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、右旋糖酐、聚乙二醇等。在一般情况下，在生物制品中的冷冻干燥过程中添加聚合物可以提高溶液的黏度；抑制小分子赋形剂（如蔗糖）的结晶；抑制溶液PH值降低；在蛋白质分子之间产生位阻作用等。