[发明专利]一种植物叶际表面微生物宏基因组检测方法

说明书

本发明提供了一种植物叶际表面微生物宏基因组检测方法，所述的检测方法中包括使用引物SEQ ID NO.1‑5和SEQ ID NO.6‑10进行PCR扩增达到文库富集的目的。本发明提供的方法使用准确高效的引物序列，节约成本和时间，从而实现植物叶际表面微生物大批量检测，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物叶际表面微生物宏基因组检测方法。

背景技术

植物叶际存在着丰富多样的微生物群体，植物为叶际微生物提供了必要的生活场所和营养物质，叶际微生物影响着植物的生长发育和代谢活动，宿主植物和叶际微生物之间互相影响，双方处在一个动态平衡的过程当中。目前，植物叶片或者根系菌群的分离和鉴定主要采用琼脂平板扩散、滤纸贴片等方法。近些年，随着分子生物学技术的发展，利用序列分析、荧光定量PCR(RT-PCR)等技术对微生物的种群进行分析鉴定越来越受到重视。随着基因测序技术的发展，高通量测序技术凭借其独特优势也被引入微生物多样性的研究技术中。但对于植物叶际表面微生物的检测目前存在以下问题：(1)传统的培养基培养方法操作繁琐，花费时间长并且污染严重，难以发现低丰度的微生物种类；(2)高通量测序时同一泳道的容量很小，不能被充分利用，降低数据的准确性，使后续测序数据不能准确分离。

中国专利201611081097.9中公开了陈化烟叶表面微生物的宏基因组测序与鉴定方法。基于微生物的种类和数量与烤烟品种、产地、时间、等级及发酵条件有关，利用高通量基因测序技术，对不同烤烟品种、产地、时间、等级的微生物菌群结构进行分析，绘制优质烟叶表面微生物菌群结构图。该发明利用宏基因组测序技术鉴定烟叶表面微生物的方法，对宣威地区3种代表性烟叶样品表面微生物进行OTU聚类分析、物种注释，获得微生物多样性信息。结果显示，芽孢杆菌属菌株在陈化烟叶中为主要优势菌，在提高陈化烟叶品质中具有一定利用价值；烟叶样品中另一较多的菌种是假单胞菌属，这一大类的细菌有生物防治、微生态调节等功能。利用该方法获得的烟叶表面微生物多样性信息，有助于发挥微生物在烟叶陈化及提高品质方面的作用。但该专利在进行文库构建时采用的引物为细菌16S rDNA引物，在检测时容易遗漏细菌外的微生物种类，导致检测结果不精准。

中国专利202110099309.0中公开了一种基于宏基因组学分析精准识别水体中未知微生物群落的方法，所述方法包括步骤(1)自水样提取宏基因组DNA；(2)DNA测序；(3)根据目标群落选择性构建参考数据库；(4)对测序数据进行组装获得组装数据；(5)对组装数据进行分箱；(6)对分箱数据进行质量测试，标记MAGs的质量，并计算测序深度；(7)根据构建的参考数据库对组装数据进行注释；(8)对MAGs做进化关系分析，进而做出宏基因组群落结构分析。该方法不依赖更新速度较慢的大型软件配套数据库，适合处理未知物种较多的样本，且可检测极低丰度物种，检测全面、快速。但该方法步骤较为繁琐，有很大的优化空间。

发明内容

为了解决上述问题，本发明在现有的通用引物基础上进行改进，提供了一款准确高效的引物序列，节约成本和时间，从而实现植物叶际表面微生物大批量检测。

一方面，本发明提供了一组用于微生物宏基因组检测的引物组合物。

所述的引物选自SEQ ID NO.1-10。

所述的引物为正向引物，选自SEQ ID NO.1-5中的一种或多种；

所述的引物为反向引物，选自SEQ ID NO.6-10中的一种或多种。

优选地，所述的引物组合物中包括正向引物SEQ ID NO.1-5中的一种或多种和反向引物SEQ ID NO.6-10中的一种或多种。

优选地，所述的引物组合物中包括正向引物SEQ ID NO.1-5和反向引物SEQ IDNO.6-10。