[发明专利]一种新型cDNA文库的制备

说明书

本发明涉及cDNA文库技术领域，且公开了一种新型cDNA文库的制备，将组织碎片和变性裂解液装入容量瓶中密封，再将其放入冰水中浸泡8min后取出，之后将容量瓶放入离心机中高速匀浆，离心速率为20‑40秒/次，之后取出容量管，加入乙酸钠和氯仿混合后密封，再将其放入冰水中浸泡8min后取出，之后再放入离心机中离心20‑40min，之后静置沉淀通过移液管转移容量管上层液体，在容量瓶中加入核酸酶抑制剂充分溶解RNA沉淀；添加两轮消减杂交及两步PCR，使Tester中代表差异表达基因的cDNA片段得到大量扩增，同时抑制了非特异性cDNA片段的扩增，使各种消减文库的特异性得到极大地提高单链Tester cDNA的均等化过程，使高、低丰度的差异表达基因都能有效分离。

技术领域

本发明涉及cDNA文库技术领域，具体为一种新型cDNA文库的制备。

背景技术

cDNA文库是指某生物某一发育时期所转录的mRNA全部经反转录形成的 cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合，具有组织或细胞特异性。 cDNA文库便于克隆和大量扩增，可以从中筛选到所需目的基因，但是传统的制备方法一般利用羟基磷灰石柱层析的方法分离杂交单体，这种技术存在着操作复杂，周期长，核酸损失量大等缺点。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种新型cDNA文库的制备，具备化了实验程序，减少了杂交体的损失量等优点，解决了操作复杂，周期长，核酸损失量大的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种新型cDNA文库的制备，所用试剂由以下重量份数组成：

DEPC水1000ml；

10％肌氨酸钠100ml；

变性裂解液250ml；

2M醋酸钠50ml；

3M醋酸钠100ml；

0.5M EDTA100ml；

10X MOPS 1L；

4x RNA Loading buffer1000ml；

变性电泳胶50ml；

变性电泳缓冲液250ml。

根据上述的一种新型cDNA文库的制备，提出一种新型cDNA文库的制备方法，包括以下步骤：

S1：准备离心管、移液管、量筒、容量瓶、药匙和试剂瓶，将研钵、移液管、量筒、容量瓶、药匙和试剂瓶用锡纸包裹后放入烤箱焙烤5h，之后将其放入0.1％焦碳酸二乙酯水浸泡过夜；

S2：将组织碎片和变性裂解液装入容量瓶中密封，再将其放入冰水中浸泡8min后取出，之后将容量瓶放入离心机中高速匀浆，离心速率为20-40秒 /次，之后取出容量管，加入乙酸钠和氯仿混合后密封，再将其放入冰水中浸泡8min后取出，之后再放入离心机中离心20-40min，之后静置沉淀通过移液管转移容量管上层液体，重复上述步骤直至容量瓶中没有乙醇气味，在容量瓶中加入核酸酶抑制剂充分溶解RNA沉淀，最后放入－80°的冰箱中保存；

S3：通过移液管从S2中容量瓶中取出RNA放入离心管中，之后添加无霉无菌水，之后加入适当体积的OBB Buffer和Oligotex Suspension混合密封，取出离心管放入70°的水中加热3min，之后在离心管中加入经过生物素标记的寡脱氧胸苷酸引物和以链霉亲和素包被的磁性球珠，之后通过磁分离器从低盐缓冲液分离出磁性球珠，再加入洗脱缓冲液，重复磁性分离步骤，得到 mRNA溶液；