[发明专利]一种新型cDNA文库的制备

权利要求书

1.一种新型cDNA文库的制备，其特征在于，所用试剂由以下重量份数组成：

DEPC水1000ml～500ml；

10％肌氨酸钠100ml～50ml；

变性裂解液250ml～125ml；

2M醋酸钠50ml～25ml；

3M醋酸钠100ml～50ml；

0.5M EDTA100ml～50ml；

10X MOPS 1L～0.5ml；

4x RNA Loading buffer1000ml～500ml；

变性电泳胶50ml～25ml；

变性电泳缓冲液250ml～125ml。

2.根据权利要求1所述的一种新型cDNA文库的制备，现提出一种新型cDNA文库的制备方法，包括以下步骤：

S1：准备离心管、移液管、量筒、容量瓶、药匙和试剂瓶，将研钵、移液管、量筒、容量瓶、药匙和试剂瓶用锡纸包裹后放入烤箱焙烤5h，之后将其放入0.1％焦碳酸二乙酯水浸泡过夜；

S2：将组织碎片和变性裂解液装入容量瓶中密封，再将其放入冰水中浸泡8min后取出，之后将容量瓶放入离心机中高速匀浆，离心速率为20-40秒/次，之后取出容量管，加入乙酸钠和氯仿混合后密封，再将其放入冰水中浸泡8min后取出，之后再放入离心机中离心20-40min，之后静置沉淀通过移液管转移容量管上层液体，重复上述步骤直至容量瓶中没有乙醇气味，在容量瓶中加入核酸酶抑制剂充分溶解RNA沉淀，最后放入－80°的冰箱中保存；

S3：通过移液管从S2中容量瓶中取出RNA放入离心管中，之后添加无霉无菌水，之后加入适当体积的OBB Buffer和Oligotex Suspension混合密封，取出离心管放入70°的水中加热3min，之后在离心管中加入经过生物素标记的寡脱氧胸苷酸引物和以链霉亲和素包被的磁性球珠，之后通过磁分离器从低盐缓冲液分离出磁性球珠，再加入洗脱缓冲液，重复磁性分离步骤，得到mRNA溶液；

S4：在S3中的mRNA溶液中加入反转录酶离心后获得第一cRNA链，取2ul第一cRNA链加入DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸三磷酸、双蒸水、异柠檬酸脱氢酶和大肠杆菌DNA连接酶混合后在20°的环境中反应2.5h，得到第二cRNA链，在第二链反应体系中，顺序加入10mM dNTP、T4DNA Polymerase和BSA，灭活后加入等体积氯仿振荡离心，连接反应完成后，将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase，然后加入Xho 10×Buffer、BSA和双蒸水，反应1.5小时后65℃灭活酶10分钟获得合成的双链cRNA；

S5：通过质粒和噬菌体载体制作克隆RNA的载体，载体去磷酸化后依次加入ddH2O、T4ligase 10x buffer、PBK(E/X)vector、cDNA、T4 DNAligase和Total在14℃的环境中，连接载体和双链cRNA；

S6：取适量PCR薄壁管，置于冰上，按以下体系依次加入：10xbuffer、Mgcl2、DNTP、T3引物、T7引物、Taq酶、双蒸水和total之后离心沉淀底，置于PCR仪上待PCR反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳，同时上1Kb DNA ladder半小时后照相，观察胶图进行cRNA文库的检测。