[发明专利]一种CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种构建简便、高效的植物多基因编辑载体方法，其包括pMK‑(1‑12)中间载体及终载体pMMK‑Cas9。载体构建的方法包括以下步骤：将多个sgRNA通过多顺反子tRNA‑gRNA方式连接到pMK(1‑12)中间载体上，每个中间载体上可以连接1‑8个sgRNAs，得到pMK(1‑12)‑PTG载体；将多个pMK(1‑12)‑PTG载体上的U6/U3表达盒连接到pMMK‑Cas9载体上，pMMK‑Cas9可以连接2个到7个pMK(1‑12)‑PTG载体上的U6/U3表达盒，得到pMMK‑PTG载体，根据不同的靶位点和小载体组合，可达到2‑56个靶位点的多基因编辑。整个流程只需要一次PCR反应和两次“金门”连接体系即可完成，流程简单快速。本发明还以该载体敲除水稻LEA基因家族25个成员为例，验证该载体多基因编辑的高效性。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种植物高效快速的多基因编辑载体及其构建方法和应用。

背景技术

CRISPR/Cas9系统作为第三代基因编辑技术，具有构建简便、标记效率高的特点，因此被广泛用于基因编辑研究。CRISP/Cas9主要包括两个核心元件：Cas表达盒和sgRNA表达盒，Cas表达盒由RNA聚合酶II等强启动子(Ubi、35S等)和NOS等终止子组成；sgRNA表达盒则由RNA聚合酶III启动子(U6或U3等)驱动，连续6个以上多聚碱基T终止。在研究中往往需要同时对多个基因进行基因编辑，在动物中进行多基因编辑只需要将多个sgRNA表达盒的质粒进行共转染即可获得多基因编辑材料，而在植物中一般需要将Cas9表达盒、sgRNA表达盒以及筛选标记共同装配到一个载体中，通过农杆菌介导的稳定遗传转化，实现多基因定点编辑。

目前最常用植物多基因编辑系统主要分为两类：一类为多转录元件系统(multi-component transcriptional unit system,MCTU)，即将多个sgRNA表达盒装配到一个载体上，这类系统的构建一般是通过多次不同的酶切连接将多个的sgRNA表达盒依次构建到载体上，这种构建过程费时费力，且由于工程化的植物内源U6、U3启动子数目有限，过度重复启动子会影响多基因编辑效率，一般MCTU系统的靶位点不超过8个；另一类被称为双转录元件系统(two-component transcriptional unit system,TCTU)，这类系统中sgRNA表达盒是将多个sgRNA通过RNA自剪切元件，如核酶、tRNA前体和Csy4等串联在一起，成为同一个转录单元，并通过RNA剪切方式将多个sgRNA分离释放。这类系统的构建利用“金门”克隆方法，通过IIS型限制性内切酶，如BsaI、Esp3 I、BbsI、AarI产生的非回文粘性末端，同时将多个DNA片段连接在一起。由于“金门”克隆方法的限制，随着DNA片段数的增多构建变得越来困难，一般一个转录单元连接的sgRNAs不超过8个，且由于启动子活性的影响，随着转录单元长度的增加会导致远离启动子的sgRNAs转录水平下降，从而影响编辑效率。

发明内容

基于以上多基因编辑存在的构建过程复杂、编辑位点数目有限的缺点，本发明提供了一种用于植物的高效快速多基因编辑载体及其构建方法，可实现对植物基因组2-56个位点进行同时编辑。该多基因编辑载体结合了MCTU和TCTU的特点，构建方法简单、快速。同时，本发明将提供的多基因编辑载体用于靶向水稻胚胎后期丰富蛋白LEA家族的25个成员，并成功获得23个位点被编辑的突变植株，说明该系统对多个位点的编辑效率高。

本发明的第一个目的是提供一种CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将多个sgRNA通过多顺反子tRNA-gRNA方式连接到pMK-(1-12)中间载体上，每个中间载体上可以连接1个到多个sgRNAs，得到pMK(1-12)-PTG载体；

(2)将多个pMK(1-12)-PTG载体上的U6/U3表达盒连接到pMMK-Cas9载体上，pMMK-Cas9连接2个到7个pMK(1-12)-PTG载体上U6/U3表达盒，得到pMMK-PTG载体。