[发明专利]一种CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法和应用

权利要求书

1.一种CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将多个sgRNA通过多顺反子tRNA-gRNA方式连接到pMK-(1-12)中间载体上，每个中间载体上可以连接1个到多个sgRNAs，得到pMK(1-12)-PTG载体；

(2)将多个pMK(1-12)-PTG载体上的U6/U3表达盒连接到pMMK-Cas9载体上，pMMK-Cas9连接2个到7个pMK(1-12)-PTG载体上U6/U3表达盒，得到pMMK-PTG载体。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述pMK(1-12)是一套12个用于CRISPR/Cas9介导的基因编辑的中间载体，其中pMK1、pMK10、pMK11各含有一个OsU6表达盒，OsU6表达盒核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；pMK2、pMK3、pMK8、pMK9各含有一个OsU3表达盒，OsU3表达盒核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；pMK4、pMK5各含有一个OsU6a表达盒，OsU6a表达盒核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；pMK6、pMK7、pMK12各含有一个OsU6b表达盒，OsU6b核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，将多个sgRNA构建到pMK(1-12)中间载体上，首先根据基因打靶位点通过CRISPR-GE网站在线设计靶序列，合成引物，

gRNA[x]-F(SEQ ID NO.5)：

5‘-TAGGTCTCCN₉N₁₀N₁₁N₁₂N₁₃N₁₄N₁₅N₁₆N₁₇N₁₈N₁₉N₂₀GTTTTAGAGCTAGA A-3’

gRNA[x]-R(SEQ ID NO.6)：

5’-CGGGTCTCAN₁₂N₁₁N₁₀N₉N₈N₇N₆N₅N₄N₃N₂N₁TGCACCAGCCGGG-3‘；

其中，N₁-N₂₀分别表示20bp靶序列的第1位至第20位上的核苷酸。