[发明专利]一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法

说明书

本发明公开了一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，包括如下步骤：1）针对目标tsRNA设计哑铃状DNA模板，使用T4连接酶将哑铃状模板缺口连接；2）目标tsRNA竞争结合DNA模板互补区，破坏DNA模板哑铃状结构，使其呈环状；DNA模板成环后作为模板，目标tsRNA作为引物，在phi29 DNA聚合酶的作用下，发生滚环扩增；3）在扩增产物中加入分子信标并进行信号检测。本发明无需对目标tsRNA进行预处理、逆转录等步骤，大大节约了时间；恒温即可扩增，对精密仪器的依赖性降低；序列相近的干扰RNA序列不完全互补，无法破坏哑铃结构，就无法开启扩增，特异性强。

技术领域

本发明属于tsRNA检测技术领域，具体涉及一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法。

背景技术

tRNA-derived small RNAs（tsRNA）是近年来发现的、存在于多种生物体内的一类非编码小RNA，来源于成熟tRNA或tRNA前体，其表达和修饰具有组织和细胞特异性。tsRNA参与应激反应、蛋白质翻译调控、核糖体生物合成、肿瘤发生、细胞增殖与凋亡、表观遗传信息的跨代传递等多种生理和病理过程，因此，检测tsRNA对研究机体的生物学功能具有重要意义。

现有的定量检测tsRNA的方法主要为PCR法，先将tsRNA逆转录为cDNA再进行实时荧光定量PCR。或者使用分子信标（MB）,一种茎环结构DNA探针，一端标记荧光基团，一端标记淬灭基团，没有靶分子时，荧光和淬灭基团距离很近，荧光被淬灭，存在靶分子时，分子信标由于序列互补打开茎环结构结合靶分子，荧光和淬灭基团分离，导致荧光回复，具有较高的特异性。

但是，PCR法检测由于小RNA的长度过短，在进行逆转录时还需设计特殊的茎环引物或使用加尾法增加长度，存在操作繁琐、耗时长、试剂昂贵等缺陷；而分子信标（MB）虽然具有较高的特异性，但灵敏度较低，不结合核酸扩增无法检测微量的小RNA。

发明内容

有鉴于此，本发明期望提供一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，能够高灵敏度高特异性地检测tsRNA。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，包括如下步骤：

1）针对目标tsRNA设计哑铃状DNA模板，使用T4连接酶将哑铃状模板缺口连接，形成闭合哑铃状结构；

2）目标tsRNA竞争结合DNA模板互补区，破坏DNA模板哑铃状结构， 使其呈环状；DNA模板成环后作为模板，目标tsRNA作为引物，在phi29 DNA聚合酶的作用下，发生滚环扩增；

3）在扩增产物中加入分子信标并进行信号检测。

这里，与PCR法相比，步骤1）中无需对目标tsRNA进行预处理、逆转录等步骤，大大节约了时间，减少了操作带来的误差，也节约了试剂，降低检测成本；

这里，步骤2）中采用滚环扩增（RCA）法，扩增时无需反复热变性，恒温即可扩增，对精密仪器的依赖性不高。

进一步地，所述DNA模板包括支点（toehold），支点（toehold）与哑铃状DNA模板互补区相连；所述支点（toehold）及哑铃状DNA模板互补区，与目标tsRNA序列互补配对。

进一步地，滚环扩增后，引入支链引物，进行超分支滚环扩增。

进一步地，所述支链引物与滚环扩增产物互补配对，不与目标tsRNA完全互补配对。

这里，步骤2）可在滚环扩增（RCA）的基础上，进行超分支滚环扩增（HRCA），以提高扩增效率，提升特异性。

图1为本发明制备哑铃状结构模板的工作原理图；图2为本发明哑铃状结构模板滚环扩增及荧光检测的工作原理图，如图1和图2所示，设计好的模板自发互补结合形成哑铃状结构，通过T₄连接酶将缺口连接，形成闭合哑铃状DNA模板；