[发明专利]一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法

权利要求书

1.一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）针对目标tsRNA设计哑铃状DNA模板，使用T4连接酶将哑铃状模板缺口连接，形成闭合哑铃状结构；

2）目标tsRNA竞争结合DNA模板互补区，破坏DNA模板哑铃状结构， 使其呈环状；DNA模板成环后作为模板，目标tsRNA作为引物，在phi29 DNA聚合酶的作用下，发生滚环扩增；

3）在扩增产物中加入分子信标并进行信号检测。

2.根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，其特征在于，所述DNA模板包括支点，支点与哑铃状DNA模板互补区相连；所述支点、哑铃状DNA模板互补区，与目标tsRNA序列互补配对。

3.根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括超分支滚环扩增，按所述步骤2）滚环扩增后，引入支链引物，进行超分支滚环扩增。

4.根据权利要求3所述的一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，其特征在于，所述支链引物与滚环扩增产物互补配对，不与目标tsRNA完全互补配对。

5.根据权利要求1或2所述的一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）在连接体系中加入哑铃状DNA模板序列、T₄连接酶缓冲液、T₄连接酶和DEPC处理水进行连接反应；连接反应后加入外切酶，进行去除未连接序列的反应；

2）配制滚环扩增体系，组分包括哑铃状DNA模板、DEPC处理水、phi29 DNA聚合酶缓冲液、phi29 DNA聚合酶、dNTPs、BSA、待测样本；进行滚环扩增反应；

3）在超分支扩增产物中加入分子信标MB，孵育后使用荧光定量PCR仪或者酶标仪检测荧光信号。

6.根据权利要求5所述的一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，其特征在于，所述步骤2）组分还包括支链引物，进行超分支滚环扩增反应。

7.根据权利要求5所述的一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，其特征在于，步骤1）所述的连接反应条件为25℃ 2h，65℃ 10min；去除未连接序列的反应条件为37℃ 10min，80℃ 20min。

8.根据权利要求5所述的一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，其特征在于，步骤2）所述的滚环扩增反应条件为30℃ 1h，65℃ 10min。

9.根据权利要求5所述的一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，其特征在于，步骤3）在扩增产物中加入分子信标MB，90℃孵育3min后缓慢降温至25℃，使用荧光定量PCR仪或者酶标仪检测荧光信号。