[发明专利]一种利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器制备方法及其应用。所述可视化生物感应器是在大肠杆菌细胞中表达爆炸物分子降解基因，包括：dntA、orf和dntB，这些基因可以降解2,4‑二硝基甲苯（2,4‑DNT）生成2‑羟基‑5‑甲基苯醌，该物质呈现红色，肉眼可见，并且在420 nm处有最大吸光值。本发明的可视化生物传感器通过降解不同浓度的爆炸物分子，生成不同浓度的降解产物2‑羟基‑5‑甲基苯醌，将爆炸物分子浓度与产生的红色降解产物含量进行偶联，实现了爆炸物分子的可视化检测，该检测操作简单、方便、安全性高。

技术领域

本发明属于基因工程和分子生物学技术领域，具体涉及一种利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备方法及其应用。

背景技术

生物传感技术是利用基因工程手段对菌株进行改造，使得该微生物在感应特定化合物或者特定化合物在微生物中的代谢产物后，微生物发生可以被检测的变化，从而达到对特定化合物进行检测的目的。这种生物传感器主要由感应元件和报告元件两部分构成，其中感应元件可特异性地感应靶标化合物，感应元件是负责基因转录的启动子、核糖体结合位点、终止子、转录调控因子等；而报告元件可在感应元件的作用下产生感应信号，一般常用的报告元件包括各种荧光蛋白和荧光素酶，分别产生各种颜色荧光和自发光等可以被检测的感应信号。这种生物传感技术被广泛应用于特定化合物的检测，其中包括2,4-DNT。2,4-DNT是爆炸物有效成份TNT分解后产生的一种挥发性物质，由于其较高的挥发性能，常被用作检测爆炸物存在的特征化学物质。以色列科学家Shimshon Belkin曾报道一种检测2,4-DNT的大肠杆菌生物传感器，这个生物传感器主要是由爆炸物分子2,4-DNT的感应元件 yqjF启动子和GFP报告元件两部分组成，对于2,4-DNT的检测可达到0.01 mg/L（NewBiotechnology, 2020, 59, 65-73），目前处于国际领先水平。然而，无论是依赖荧光蛋白产生的荧光还是依赖荧光素酶的自发光都需要仪器进行信号的采集和处理，依赖荧光蛋白产生荧光时更是需要使用仪器进行特定波长的光激发，无法达到肉眼可以观察到的程度。

洋葱伯克霍尔德氏菌中的 dnt操纵子（ dntABDEG）表达的蛋白能够降解2,4-DNT，其中DntA与DntB蛋白能够将2,4-DNT降解为一种红色物质2-羟基-5-甲基苯醌，使培养基的颜色变为肉眼可见的红色。因此我们利用这个操纵子中的 dntA、 dntB两个基因构建一种生物传感器，这种生物传感器可以感应爆炸物分子2,4-DNT，并将其降解为肉眼可见的红色物质。此外，我们还通过启动子串联和优化RBS的方法来提高生物感应器性能，使之能够更高效的实现颜色变化，从而达到可视化检测的目的。

发明内容

为了实现爆炸物分子的可视化检测，本发明提供了一种利用爆炸物分子降解途径基因合成生物感应器的制备方法及其在爆炸物分子可视化检测中的应用。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

（1）克隆爆炸物分子降解基因，纯化回收后，与pACYCDuet-1质粒同时双酶切，然后将质粒酶切片段与爆炸物分子降解基因片段以2:1的质量比进行连接，连接产物转化感受态细胞，于含抗生素的LB 固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒p- dntAB；