[发明专利]一种利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）克隆爆炸物分子降解基因，纯化回收后，与pACYCDuet-1质粒同时双酶切，然后将质粒酶切片段与爆炸物分子降解基因片段以2:1的质量比进行连接，连接产物转化感受态细胞，于含抗生素的LB 固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒p-dntAB；

（2）扩增启动子yqjF基因片段，纯化回收后，酶切启动子yqjF基因片段和重组质粒p-dntAB，然后将质粒酶切片段与启动子yqjF基因片段以25:1的质量比进行连接，连接产物转化感受态细胞，于含抗生素的LB 固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒p-yqjF-dntAB；

（3）利用PCR克隆重组质粒p-yqjF-dntAB，使p-yqjF-dntAB质粒线性化，扩增启动子yqjF基因，再利用平末端连接的方式连接p-yqjF-dntAB质粒片段和启动子yqjF基因片段，从而使两个yqjF启动子串联在一起，得到重组质粒p-yqjF-yqjF-dntAB；针对RBS1和RBS2序列分别设计引物，将RBS1和RBS2序列分别插入到p-yqjF-yqjF-dntAB质粒上，得到重组质粒p-yqjF-yqjF-RBS1-dntAB和p-yqjF-yqjF-RBS2-dntAB；

（4）将所述重组质粒p-yqjF-dntAB或重组质粒p-yqjF-yqjF-RBS1-dntAB或重组质粒p-yqjF-yqjF-RBS2-dntAB 分别转化感受态细胞，筛选到的阳性克隆，得到工程菌株；

（5）将所述工程菌株于含抗生素的LB液体培养基活化，再转接至M9培养基中培养，得到可视化生物感应器；

所述爆炸物分子降解基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其来源于伯克霍尔德氏菌Burkholderia cepacia，包括dntA基因、orf基因、dntB基因；

所述启动子yqjF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其来源于大肠杆菌Escherichia coli；

所述RBS1、RBS2的核苷酸序列分别如下：

RBS1：GTTTGCCCAGGGAAGTAGTTAAGAAAGGAGGTCTTTTT；

RBS2：AAGGTATGAGCTTATGCGCC。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中将工程菌株于含氯霉素的LB液体培养基中，过夜培养活化，再转接至M9培养基中培养至OD₆₀₀为0.2，得到可视化生物感应器。

3.权利要求1或2所述的利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备方法中制备得到的可视化生物感应器。

4.权利要求3所述的可视化生物感应器在用于爆炸物分子的可视化检测中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述可视化生物感应器的使用方法为：将可视化生物感应器培养活化后，加入待测样品后进行共培养，肉眼观察培养液颜色，红色越明显则待测样品中爆炸物分子的浓度越高。

6.权利要求3所述的可视化生物感应器在用于制备提高爆炸物分子检测可视度的生物制剂中的应用。