[发明专利]一种DNA连接的方法及其应用

说明书

本发明提供了一种DNA连接的方法及其应用。本发明首先设计了DNA连接用片段，其包括第一DNA片段和/或第二DNA片段。本发明设计的DNA片段不能发生自连接，且与待测DNA的连接有较好的方向性，将待测DNA经过酶切后，在DNA连接酶的作用下与本发明的DNA连接用片段进行连接，按照3’端至5’端的顺序形成第一DNA片段‑待测DNA‑第二DNA片段的结构。本发明的技术特别适用于痕量DNA的连接、DNA定量测定与测序文库的构建。

技术领域

本发明是关于一种DNA连接的方法及其应用，具体是关于一种特别适用于痕量DNA连接的方法、DNA定量测定与测序文库的构建，属于DNA检测领域。

背景技术

在核酸的研究中，常需要将两个或两个以上的核酸片段链接，例如在DNA分子上连接接头，接头一般为一段短的平末端或粘性末端的人工合成核苷酸片段。接头和核苷酸的连接效率直接影响测序文库构建的质量，目前对痕量DNA的连接无可行的方法。

精确定量DNA拷贝数是现代分子生物学和医学的重要应用之一。常见的DNA定量手段主要有紫外分光光度法、荧光染料法、聚合酶链式反应等。紫外分光光度法定量操作简单，对设备的要求也低，缺点是灵敏度和特异性都较低，且易受样品中其他杂质的干扰。荧光染料法是基于荧光染料与核酸分子结合发出荧光信号的强度与结合的核酸分子数成正比的原理，灵敏度和特异性都较高，但仍然受DNA浓度的限制，无法准确检测或检测不到微量DNA，且会受到其他类型核酸的干扰。紫外分光光度法和荧光染料法均无法检测DNA中特定序列模板的拷贝数。近年来，荧光定量PCR和数字PCR常用于微量DNA及特定序列模板拷贝数的定量。但荧光定量PCR和数字PCR都是基于荧光信号的有无和高低来反应DNA或特定模板的量，无法直接读取DNA序列，其准确性和可靠性都基于引物和探针的设计，结果的准确性可能会受到非特异性扩增的影响，并且其灵敏度普遍较低，不足够用于微量或痕量DNA的定量检测。此外，在很多研究中，还利用了磁球技术、DNA探针标记物等方法将检测信号进一步放大进行。

近几年来包括人、拟南芥以及水稻等越来越多的基因组被测序。全基因组测序为重要基因的克隆、基因的系统进化和基因组学研究提供了坚实的平台。但依然有部分珍贵物种由于个体较小获得的基因组浓度较低等原因得到的DNA量低于按照现有的建库流程和方法建库难度非常大。目前针对低起始量的建库方法主要有转座酶建库和TA连接或平末端连接建库。转座酶建库主要是利用转座酶随机切割基因组并在片段两端加上接头，然后进行扩增建库。该方法是一种高效的低起始量建库方法。但这种建库方法有一个较为明显的缺点就是其使用转座酶随机切割打断过程中易受到样本中杂质的干扰导致打断建库失败，且酶切有偏向性，导致文库失真。TA连接或平末端连接建库无法进行低于20ng的建库。在起始量小于5ng时，由于连接效率较低，若需要达到某些应用，如起始50ng的捕获测序，只能通过连接后增加扩增循环数较达到目的。这样会导致文库中不同DNA片段比例失真或丢失。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种DNA连接新技术，提高连接效率。

为实现上述目的，一方面，本发明提供了一种DNA连接用片段，其包括第一DNA片段和/或第二DNA片段，其中：

第一DNA片段具有式I所示核苷酸序列：

X1-X2-X3-X4           式I

其中，X1为12-50个任意核酸N；

X2为一段目的需求碱基，例如可以是MLBAC特定序列、Illumina Truseq一端接头序列等，具体可选自SEQ ID No.1～SEQ ID No.3中的任一序列；

X3为6-15个T碱基；

X4为与X2基本上反向互补的碱基序列，例如可选自SEQ ID No.4～SEQ ID No.6中的任一序列；

第二DNA片段具有式II所示核苷酸序列：