[发明专利]一种双菌生物催化剂及在合成西他列汀中的应用

说明书

本发明涉及生物制药技术领域，尤其是一种双菌生物催化剂及在合成西他列汀中的应用，该双菌生物催化剂由枯草芽孢杆菌全细胞催化剂和巨大芽孢杆菌全细胞催化剂组成，二者的质量比为1:0.1～1，所述枯草芽孢杆菌全细胞催化剂由含有如SEQ ID NO：1所示外源基因的重组枯草芽孢杆菌的工程菌制得。用于合成西他列汀时，由化合物II作为起始原料，在缓冲液、助溶剂、辅酶PLP、氨基供体的存在下，经双菌生物催化剂催化转化为西他列汀，其反应路线为，

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体领域为一种生物催化剂及西他列汀的生物合成方法。

背景技术

西他列汀(Sitagliptin)的化学名为(3R)-3-氨基-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并 [4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮(结构式如下所示)。

磷酸西他列汀(sitagliptin phosphate)是一种新型抗II型糖尿病药物，服用方式为口服，毎次一片，一次约100mg剂量，在2006年10月由默沙东公司成功研制并开发，经美国 FDA批准上市，是史上第一个用于治疗II型糖尿病的二肽基肽酶IV(DPP-4)抑制剂类药物。

西他列汀的化学制备法与生物制备法均有报道，其中以ATA177转氨酶用于制备西他列汀最为广泛，国内外多所企业、高校对ATA117转氨酶的优化进行了研究。如CN103608355A中，默沙东公司通过树脂固载ATA117，对转氨酶ATA117多次套用，降低了其生产成本。CN109777813A中，浙江工业大学通过将转氨酶-PLP共固定化，进行西塔列汀的制备，该方法稳定性好，固载酶使用寿命长，有机溶剂耐受性好，可多次重复利用。

转氨酶催化反应是制备西他列汀的最后一步反应，大肠表达系统制备转氨酶通常需要添加细菌内毒素的去除步骤，使用常规枯草芽孢表达系统，虽然无细菌内毒素产生，但表达量过低，生产应用价值偏低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双菌生物催化剂及在合成西他列汀中的应用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种双菌生物催化剂，由枯草芽孢杆菌全细胞催化剂和巨大芽孢杆菌全细胞催化剂组成，二者的质量比为1:0.1～1，所述枯草芽孢杆菌全细胞催化剂由含有如SEQ ID NO：1所示外源基因的重组枯草芽孢杆菌的工程菌制得。

其中，枯草芽孢杆菌的菌株为Bacillus subtili168，表达质粒为pHT43或pHT01。

其中，巨大芽孢杆菌的菌株为Bacillus megateriumATCC14581模式菌株(ATCC菌种库)。

其中，所述枯草芽孢杆菌全细胞催化剂的制备方法具体为：

(1)将如SEQ ID NO：1所示的生物酶基因进行全合成后，设计上下游引物F、R，如SEQ ID NO：2-3所示，进行PCR扩增，PCR条件为：98℃3min，95℃30s，55℃90 s，72℃90s，35个循环；PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTARMix25μL；

(2)采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度；BamHI和ZraI酶切胶回收产物及pHT01质粒，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度；目的基因与载体pHT01连接，连接体系：目的基因4μL，载体pHT01 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接；将构建好的载体通过转化技术导入Bacillus subtilis168中，涂布在含的LB抗性平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含生物酶基因的重组工程菌Recombinant-01；